ZMĚNY V REGULACI SIGNÁLNÍ DRÁHY MTOR, KTERÉ SE PODÍLÍ NA MALIGNITĚ VYVOLANÉ TRANSFORMACÍ BUNĚK ONKOGENEM V-SRC.

Maligní buněčný růst je spojen se změnami v expresi onkogenů, antionkogenů a jiných genů, které kódují proteiny podporující růst a je také často spojena s deregulací proteinů, které se podílí na přenosu informačních signálů v buňce. Několik signálních drah zprostředkovává účast těchto signálů na mimobuněčných, nitrobuněčných a mezibuněčných komunikacích tak, aby se dostaly do buněčného jádra a aktivovaly zde vybrané geny a nebo na ribosomech modulovaly translaci jejich transkriptů. Informační signály jsou zejména přenášeny a zesilovány kaskádami proteinkináz, katalyzujících fosforylaci tyrosinu nebo serinu/treoninu v molekulách jejich specifických substrátových proteinů. Aktivace proteinkinázových kaskád je velmi efektivní mechanismus pro přenos signálů v savčích buňkách, protože dovoluje rychlou a specifickou odpověď buněk, dokonce i na malé změny v mimobuněčných a nitrobuněčných signálech.
Translační kontrola, která je hlavním regulačním mechanismem biosyntésy bílkovin, je zprostředkována signálními drahami, které ovlivňují fungování proteosyntetické mašinérie. Fosforylace proteinových složek translačního aparátu je nejdůležitější prostředek pro kontrolu průběhu translace mRNA na ribosomu. Translační kontrola genové exprese se odbývá hlavně v iniciační fázi, reversibilní fosforylací několika iniciačních faktorů a fosforylací proteinu S6, který je součástí malé 40S podjednotky eukaryotických ribosomů. Předpokládá se, že fosforylace ribosomálního proteinu S6 se účastní interakcí mezi 40S ribosomální podjednotkou a mRNA. Ribosomální podjednotky obsahující fosforylovaný S6 protein se přednostně inkorporují do polyribosomů ve srovnání s nefosforylovanými podjednotkami.
Aktivovaná tyrosin-specifická proteinkináza Src je zapojena do mnohých mechanismů, které jsou zodpovědné za transformaci normálních buněk v maligní fenotyp buňky transformované. Abychom rozpoznali signální mechanismy nebo dráhy, které se podílejí na procesu buněčné transformace vyvolané onkogenem v-src, analyzovali jsme signální dráhu v jejímž středu je regulační protein mTOR (mammalian target of rapamycin). Signály přenášené touto drahou kontrolují několik kroků iniciace translace. Rapamycin, který je specifickým inhibitorem TOR, způsobuje snížený buněčný růst, zpomalení buněčného cyklu a zpomalení proliferace. Tyto vlastnosti rapamycinu vedly k tomu, že jeho syntetické analogy, jako je CCL-779 a RAD001 (vyrobené firmou Novartis), jsou nyní intenzivně zkoumány a ověřovány jako možná účinná protinádorová léčiva při léčbě rakoviny a jsou nyní testovány v I.- III. fázi onkologických klinických testů mnohých lidských nádorů. Je tedy možné, že regulace mTOR a jeho substrátů mohou být významné pro více cílenou a selektivní chemoterapeutickou strategii a mTOR tak může představovat nový a nadějný cíl pro terapeutický zásah.
Signální dráha řízená na mTOR je během maligní transformace a rakovinného bujení mnohých lidských nádorů aktivována. mTOR se čím dále tím více projevuje jako jeden z hlavních regulátorů růstu a proliferace eukaryotických buněk, regulující navíc i velikost buněk, orgánů i organismů. Integruje informace vysílané přísunem a stavem živin v buňce (aminokyselin, energie a růstových faktorů) tak, aby byl regulován buněčný růst a buněčný cyklus koordinovaně. Toto se děje, přinejmenším částečně, regulací proteosyntézy prostřednictvím substrátů mTOR. Nejlépe charakterizované cílové proteiny mTOR jsou dvě skupiny proteinů, které kontrolují translaci mRNA. Jedna skupina obsahuje translační represorové proteiny 4E-BPs, které regulují aktivitu iniciačního faktoru 4E (eIF4E). Druhou skupinu proteinů představují ribosomální S6 proteinkinázy (S6Ks), které katalyzují fosforylaci ribosomálního proteinu S6. Ribosomální protein S6 je fyziologický substrát proteinkinázy p70 S6K. Regulace aktivity této proteinkinázy je velmi komplexní a je representována hierarchickou fosforylací několika míst v její molekule katalyzovaných různými jinými proteinkinázami.
Proteinkinázy katalyzující fosforylaci ribosomálního proteinu S6 a translační represorové proteiny 4E-BPs se podílejí na kontrole translace specielně těch mRNA, jejichž translace je za normálního stavu buňky snížena. Jsou to většinou mRNA kódující proteiny, které se účastní regulace buněčného růstu, např. proteiny kódované protoonkogeny nebo onkogeny jsou za normálních podmínek v buňkách velmi neefektivně překládány. Jejich translace je selektivně regulována rapamycin-senzitivní signální dráhou mTOR a aktivace této dráhy může tak mít za následek zvýšení proteosyntézy způsobené dodatečným selektivním zvýšením exprese proteinů kódovaných těmito mRNA.
Jedna z těchto specifických skupin jsou mRNA, které obsahují ve své molekule 5´TOP (olygopyrimidový trakt na 5´konci mRNA). Tyto mRNA kódují primárně ribosomální proteiny a proteinové složky translačního aparátu. Jejich translace je stimulována aktivací proteinkináz S6K následovanou fosforylací ribosomálního proteinu S6. Přednostní translace 5´TOP mRNA na ribosomech může být mechanismus, kterým p70 S6K reguluje buněčný růst. O velkém významu aktivity p70 S6K v lidském nádorovém bujení svědčí zvýšená translace mRNA kódujících ribosomální proteiny, která byla zjištěna v rozličných nádorech.
Již dříve jsme zjistili, že v křeččích fibroblastech, transformovaných onkogenem v-src, je nejen zvýšená exprese a aktivita jeho produktu, onkoproteinu v-Src, ale i zvýšená celková proteosyntéza. Přibližně 20% celkové proteosyntézy v transformovaných buňkách představuje biosyntéza proteinů, které jsou kódovány specifickou skupinou mRNA, jejíž translace je kontrolována rapamycin-sensitivními mechanismy zapojenými v signální dráze řízené mTOR. Jak proteinkináza p70 S6K, tak i translační represorový protein 4E-BP1 mají zvýšenou aktivitu v buňkách transformovaných v-src onkogenem. Jestliže však byly buňky kultivovány v přítomnosti rapamycinu, docházelo u nich ke snížení fosforylace i aktivity p70 S6K doprovázené inhibicí fosforylace S6 proteinu, což potvrdilo, že ribosomální protein S6 a jeho fyziologická proteinkináza p70 S6K jsou kontrolovány signální drahou mTOR v transformovaných buňkách. Rapamycin také efektivně snižoval onkogenní transformaci křeččích buněk vyvolanou v-src onkogenem, jak ukázalo snížení tvorby kolonií transformovaných buněk v měkkém agaru účinkem rapamycinu.
Přítomnost p70 S6K v imunoprecipitátech transformovaných buněk získaných pomocí specifické protilátky proti proteinu Src a přítomnost proteinu Src v imunoprecipitátech z těchto buněk získaných imunoprecipitací specifickou protilátkou proti p70 S6K ukázaly, že oba proteiny spolu interagují. O přímé interakci mezi Src a p70 S6K také svědčí výsledek testování vazby p70 S6K na fúzované proteiny GST se Src-SH2 a Src-SH3 doménami, kdy jsme zjistili vazbu p70 S6K na SH3 homologní doménu proteinu Src.
Pro charakterizaci vazebného místa pro Src v molekule p70 S6K jsme použili mutant p70 S6K, který byl zkrácen o nekatalytickou C-koncovou doménu, obsahující několik prolinových zbytků. Tento mutant byl exprimován v buňkách, které byly transformovány onkogenem v-src a v netransformovaných buňkách. Transfekce buněk mutantem p70 S6K měla za následek zvýšenou fosforylaci S6 ribosomálního proteinu potvrzující fakt, že p70 S6K je inhibována C-koncovou pseudosubstrátovou autoinhibiční doménou. Zkrácená molekula p70 S6K se ale také vázala na GST-Src-SH3, což ukazuje na to, že její C-koncová doména není do interakcí se Src zapojena.
Zjistili jsme tedy, že onkogenní transformace vyvolaná v-src je závislá na některých proteinech, které kontrolují translaci. Transformační aktivita související se zvýšenou fosforylací a aktivací p70 S6K a represoru 4E-BP1 je inhibována rapamycinem. Rapamycin-sensitivní aktivace signální dráhy mTOR vlivem zvýšené aktivity Src, tak může vést k nekontrolované selektivní expresi proteinů, které jsou zapojeny do maligního procesu vyvolaného transformací onkogenem v-src. Je stále více jasné, že mTOR může být selektivním cílem pro nádorovou terapii a porozumění jeho role v buňce může mít přímé klinické aplikace v lidských nemocech. Inhibice signalizace řízené mTOR v nádorových buňkách může vykazovat podobný efekt jako nedostatek živin a růstových faktorů, které limitují růst buněk a významně snižují proliferaci.

Tato práce byla finančně podporována grantem č. 301/04/0550 Grantové agentury České republiky a výzkumným programem AVOZ 50520514 Akademie České republiky.