Změny neuroblastomových linií při experimentální chemorezistenci

Přes úspěchy pediatrické onkologie zůstává neuroblastom vysokého rizika (HR NBL) jedním z nejhůře léčitelných nádorů dětského věku. Proto je snaha o jeho ovlivnění novými léky. Protože chemorezistence je jednou z hlavních příčin selhání chemoterapie, studujeme rezistenci buněk HR NBL k některým látkám s protinádorovým účinkem. Zaměřili jsme se na studium rezistence buněk HR NBL k používaným cytostatikům doxorubicinu a vinkristinu a látkám, které vykazující protinádorové účinky – BS-RNáze a ellipticinu.
Ellipticin má více mechanizmů účinku: interkalaci DNA, inhibici topoizomerázy II a fosforylace p53, odpřahování oxidativní fosforylace v mitochondriích, regulaci exprese cyklinu B1 a Cdc2 a fosforylaci Cdc2. Mechanizmus protinádorového účinku Rnáz není plně objasněn. Předpokládá se inhibice proteosyntézy štěpením tRNA, uplatňuje se i štěpení rRNA, aktivace kaspáz a snížení exprese Bcl-2. Ani mechanizmus cytotoxických a antiproliferativních účinků doxorubicinu nebyl dosud plně vysvětlen. Doxorubicin je cytostatikum ze skupiny antracyklinů, tvořící komplex s DNA interkalací mezi páry nukleotidových bází, důsledkem je narušení syntézy DNA, DNA-dependentní syntézy RNA a proteosyntézy. Interkalace spouští štěpení DNA pomocí topoizomerázy-II, což naruší terciární strukturu DNA. Doxorubicin se podílí na oxidačních a redukčních reakcích: řada NADPH-dependentních buněčných reduktáz je schopna redukovat doxorubicin na volné radikály semichinonu, které reagují s molekulárním kyslíkem za vzniku vysoce reaktivních sloučenin. Další místo působení doxorubicinu je na úrovni buněčné membrány: váže se na lipidy buněčné membrány a ovlivňuje tak řadu buněčných funkcí. Protinádorový a cytotoxický účinek vinkristinu je dán několika mechanizmy. Vinkristin interaguje s mikrotubulárním
systémem, přičemž dochází ke zničení mikrotubulů a všech struktur obsahujících mikrotubuly, jako např. dělící vřeténko. Chromozómy se tak nedostanou do jádra dceřiných buněk. Selektivně inhibuje v nádorových buňkách opravné mechanizmy DNA a blokuje účinek DNA-dependentní RNA polymerázy, což inhibuje syntézu RNA.

Primární i získaná rezistence nádorových buněk k cytostatikům je podmíněna řadou mechanizmů. Nejčastěji se jedná o zvýšenou schopnost odstranit cytostatika z buňky (P-glykoprotein–produkt genu MDR1, MRP, LRP), detoxifikovat je (glutathion-Stransferáza, metalothioneiny, monooxygenázy), zabránit vzniku apoptózy (zvýšená exprese Bcl-2) nebo zvýšit opravu poškozené DNA (alkylguaninDNA alkyltransferáza, O6-metylguanin-DNA transferáza). Jindy jsou v nádorové buňce neaktivní enzymy aktivující cytostatika nebo jsou modifikované cíle cytostatik (topoizomeráza I a II, dihydrofolátreduktáza). Metodou komparativní geonomové hybridizace (CGH) byly popsány nově vzniklé amplifikace a delece u buněčných linií u kterých byla experimentálně navozená rezistence k cytostatikům.
Cílem naší práce bylo pomocí CGH vyšetřit čtyři HR NBL buněčné linie rezistentní na BS-RNázu, ellipticin, vinkristin nebo doxorubicin. Při CGH vyšetření jsme porovnali DNA parentální linie UKF-NB4 s DNA zdravého dobrovolníka a prokázali změny odpovídající HR NBL zahrnující amplifikaci N-myc (2p24), zmnožení 17q a deleci 1p32.2-ter. Dále jsme porovnali DNA parentální linie s DNA rezistentních linií ke zjištění zmnožení nebo ztráty DNA, které mohou vyvolat chemorezistenci. Pomocí CGH jsme prokázali ztrátu 2p24 u všech čtyřech rezistentních linií odpovídající snížení počtu kopií amplifikovaného N-myc.
Tento úbytek kopií N-myc genu jsme ověřili metodou FISH, kterou bylo možné stanovit přesný počet kopií v každé buňce. Počet nadbytečných kopií byl počítán jako počet kopií N-myc snížený o počet centromer druhého chromozomu. Buňky parentální linie UKF-NB4 mají průměrně 62 kopií. U linie rezistentní k ellipticinu byl počet kopií snížen na 38 kopií, u linie rezistentní k BS-RNáze na 44 kopií, stejně tak k vinkristinu na 44 a k doxorubicinu na 43 kopií. Rozdíly mezi počtem kopií v parentální linii a v jednotlivých rezistentních liniích byly statisticky významné (t-test, p < 0,05). Amplifikace N-myc u HR NBL koreluje s agresivním růstem a velmi nepříznivou prognózou. V průběhu léčby se nepopisují významné změny počtu kopií. U rezistentních linií, připravených kultivací v mediu s přídavkem protinádorové látky, se počet kopií snížil. Metodou RT PCR v reálném čase jsme zjišťovali expresi mRNA N-myc. Parentální linie má ve srovnání se vzorkem leukocytů periferní krve zdravého dobrovolníka expresi o více než 3 řády vyšší. Všechny čtyři rezistentní linie ve srovnání s parentální linií exprimovaly N-myc přibližně o jeden řád méně.
Ve všech vyšetřovaných liniích byla průtokovým cytometrem měřena intenzita exprese P-glykoproteinu jako průměrná intenzita fluorescence (MEF). Linie rezistentní k vinkristinu a doxorubicinu mají významně zvýšenou expresi P-glykoproteinu. Tento nález je v souladu s amplifikací v oblasti 7q21, kde se nachází gen MDR1. Kromě změn ve stupni amplifikace a exprese N-myc, obě rezistentní linie vykazují ztrátu v oblasti 17q, která může způsobit chemorezistenci delecí genu topoizomerázy IIα. Společnou změnou je ztráta oblasti 19q, kde je gen cytochromu P450 (19q13.2).
Závěrem lze shrnout, že chemorezistence k jednotlivým protinádorovým látkám je komplexní děj, který je podmíněn více mechanizmy.
Práce vznikla za finanční podpory GA ČR grant č. 523/04/0755 a MŠMT VZ č. 0021620813.