Změny genomu u chemorezistentních linií odvozených od neuroblastomu

Příčinou mnoha neúspěchů chemoterapie je schopnost buněk vytvořit systémy obcházející účinky cytostatik, tj. schopnost stát se vůči cytostatikům rezistentní. Je-li buň ka necitlivá již při první aplikaci cytostatika, jedná se o primární (přirozenou) rezistenci. Vznikne-li rezistence až v průběhu cytostatické léčby, jedná se o získanou (sekundární) rezistenci. Dojde tedy k tomu, že původně citlivé buňky přestávají na léčbu reagovat. Se ztrátou citlivosti k jednomu cytostatiku často přichází také rezistence ke strukturně podobným přípravkům. V tom případě se jedná o tzv. zkříženou rezistenci. Pokud je buň ka rezistentní i k léčivům lišícím se strukturou a mechanismem účinku, jde o mnohočetnou lékovou rezistenci (MDR). Touto formou rezistence vysvětlujeme necitlivost buněk při použití zcela nových, odlišných cytostatik. MDR byla poprvé popsána roku 1970 na buněčné linii z čínského křečka a na linii myší leukémie P388. Vznik rezistence je obvykle spojen se změnami farmakokinetiky (rychlá inaktivce či vylučování cytostatika), změnami cytokinetiky (při růstu nádorů většina buněk přechází do G0 fáze, kdy jsou necitlivé k řadě cytostatik, ve zvětšujícím se nádoru vznikají mutace, což vede k heterogenitě populace s různou citlivostí jednotlivých klonů) a strukturálními či funkčními změnami buňky (zahrnují zvýšenou intenzitu oprav DNA, nebo změny v intracelulární distribuci léčiv).
U rezistentních buněk pozorujeme několik typů změn, které lze rozdělit do tří skupin:

1. 
   
2. Fyziologické – ovlivňují strukturu plazmatické membrány, cytoplazmatické pH, dochází také ke zvýšené vakuolizaci a změně struktury lysosomů.
   
3. Změny exprese a aktivity některých buněčných proteinů.
   
4. Snížená schopnost akumulovat cytostatika.
   

Mechanizmy chemorezistence mohou být zkoumány na úrovni exprese (mRNA nebo proteiny) i na úrovni DNA. V předkládané studii jsme se zaměřili na změny genomu u buněčných linií odvozených od neuroblastomu vysokého rizika s experimentálně navozenou chemorezistencí. K dispozici máme dvě „mateřské“ buněčné linie (UKF-NB3 a UKF-NB4) a od každé z nich odvozené tři linie linie rezistentní k vinkristinu, doxorubicinu a k cisplatině. Chemorezistentní linie byly získány kultivací buněk ve stoupající koncentraci příslušného cytostatika. Ke studiu genomu jsme použili metodu komparativní genomické hybridizace (CGH). CGH umožňuje průkaz změn počtu kopií sekvencí DNA (amplifikací a delecí) celého genomu, neodhalí však balancované translokace nebo inserce a kompletní triploidii nebo tetraploidii (Kallioniemi, A., et al 1992). Výhodou je, že nevyžaduje dělící se buňky, ale k vyšetření postačí izolovaná DNA a ve srovnání s karyotypickým vyšetřením odhalí amplifikace nebo delece menšího úseku. CGH nevyžaduje znalost o možných chromozomálních změnách, jejichž přítomnost ostatní metody jako je PCR, RT PCR nebo FISH spolehlivě a citlivě potvrdí nebo vyloučí. CGH je v současnosti považována za metodu vhodnou pro vyšetřování solidních nádorů (Thorner PS a Squire JA, 1998, Tachdjian G a kol., 2000). Pro porovnání změn u chemorezistentních linií jsme metodu modifikovali a jako referenční DNA jsme nepoužili DNA získanou od zdravé osoby, ale DNA izolovanou z příslušné mateřské linie. Tím jsme detekovali pouze rozdíly, které vznikly v důsledku chemorezistence.
Linie UKF-NB3 a UKF-NB4 byly charakterizované molekulárně genetickými znaky nepříznivé prognózy – amplifikací N-myc, zmnožením 17q a ztrátou 1p36.2 – 36.3 (Maris a Matthay, 1999, Schwab, 1999). Obě linie rezistentní kdoxorubicinu a vinkristinu jsme prokázali amplifikaci genu MDR1, kterou jsme nenašli u linií rezistentních k cisplatině. U všech rezistentních linií jsme prokázali řadu různých dalších zmnožení a ztrát, které však nejsme dosud schopni přiřadit konkrétním genům.

Literatura

1. 
   
2. Kallioniemi, A., et al. (1992) Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science, 258: 818-821
   
3. Maris, J.M. and K.K. Matthay (1999): Molecular biology of neuroblastoma. J Clin Oncol, 17: 2264-2279.
   
4. Schwab, M. (1999): Human neuroblastoma: from basic science to clinical debut of cellular oncogenes. Naturwissenschaften,
   86: 71-78.
   
5. Tachdjian G, Aboura A., Lapierre JM a Viguié F (2000): Cytogenetic analysis from DNA by comparative genomic hybridization. Ann. Génét., 43:147-154
   
6. Thorner PS a Squire JA (1998): Molecular genetics in the diagnosis and prognosis of solid pediatric tumors. Ped, Devlopment, Patholoogy, 1:337-365
   

Práce vznikla za finanční IGA MZ ČR grant NC/7441-3 a MŠMT, výzkumné záměry č. 111300005.