Zavedení a optimalizace neradioaktivního testu cytotoxicity pro imunoterapeutické studie u nádorových onemocnění

1. Úvod
Vzhledem k imunogenní povaze nádorových buněk hraje buněčná imunita klíčovou roli při ochraně organismu proti nádorovému onemocnění. Buňky imunitního systému jsou schopny rozpoznat nádorové buňky a v konečném důsledku je zničit. T lymfocyty jsou klíčovou součástí imunitního systému a jsou nezbytné pro buňkami zprostředkované imunitní reakce, které jsou zpravidla antigen-specifické. V současné době je stále více využíván protinádorový potenciál T lymfocytů⁽¹⁾. Je tudíž žádoucí ověřit cytolytickou aktivitu T lymfocytů in vitro, vzhledem k jejich klíčové roli při eliminaci nádorových buněk.
Nejčastěji používaným testem cytotoxicity in vitro je test s radioaktivním izotopem chromu 51Cr. Tento test má některé nevýhody: především dochází k vysokému spontánnímu uvolňování 51Cr ze značených buněk (což zapříčiňuje vysoké procento nespecifického pozadí), 51Cr působí na populaci efektorových buněk, některé buněčné populace je obtížné označit 51Cr, test má poměrně nízkou senzitivitu a představuje nezanedbatelná rizika spojená s použitím radioaktivního materiálu. Přes všechny tyto nedostatky je používán již přes 30 let, neboť donedávna nebyl k dispozici jiný alespoň stejně senzitivní a reprodukovatelný test.
S rozvojem průtokové cytometrie jsou hledány nové způsoby detekce apoptotických a nekrotických buněk. Jedním z nových testů je test s využitím 5-(6-) karboxyfluorescein diacetát sukcinimidyl esteru (CFSE) ^{(2, 3)}. Podstatou barvení CFSE je odlišení jednotlivých populací. CFSE může být použito k označení buď efektorových buněk nebo terčových buněk ve smíšené kultuře in vitro^{(4, 5, 6)}. Pozdně apoptotické a nekrotické buňky lze dále odlišit pomocí barviva propidium iodidu (PI) nebo 7-aminoaktinomycinu D (7-AAD). Tyto buňky mají poškozenou buněčnou membránu a nejsou schopné vylučovat kladně nabitá barviva jako jsou PI a 7-AAD. Ta se v buňce vážou na nukleové kyseliny a komplex barviva s nukleovou kyselinou lze detekovat průtokovým cytometrem⁽²⁾.
Cílem naší práce bylo zavést neradioaktivní cytotoxický test s možností měření průtokovým cytometrem a ověřit jím cytotoxický efekt potenciálně nádorově-specifických T lymfocytů u pacientů. Test byl zaváděn na in vitro modelu specifických T-lymfocytů cytotoxických vůči nádorové linii buněk mnohočetného myelomu ARH 77. Dalším cílem bylo použít tento test k ověření specifického cytotoxického efektu T lymfocytů u několika pacientů s nádorovým onemocněním.

2. Materiál a metodika
2.1 Použité buňky a buněčná linie
Nádorová linie myelomových buněk (MB) ARH 77 byla kultivována v médiu RPMI 1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA) s 10% fetálním telecím sérem (FCS, Sigma, ČR), penicilinem a streptomycinem (Sevac, ČR) při 37°C s 5% CO₂. Nádorové buňky u pacientů s mnohočetným myelomem (MM) byly identifikovány a imunomagneticky separovány na základě povrchového znaku CD 138+. Melanomové buňky pacientů byly získány při chirurgickém výkonu. Nádorový antigen byl připraven ozářením buněk dávkou 60 Gy.
Efektorové T lymfocyty byly izolovány jako mononukleární buňky (MN) z nesrážlivé periferní krve zdravých dárců z transfuzní stanice ve FN Brno nebo od pacientů s MM či melanomem po podepsání informovaného souhlasu metodou gradientové centrifugace (Histopaqueu 1077, Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika) a kultivovány v kompletním médiu (KM) obsahujícím X-VIVO 15 (50mg/l gentamycin, 2mM L-glutamin, 25mg/ml hepes pufr (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA) s tepelně inaktivovaným 10% lidským AB sérem (Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika) při 37°C s 5% CO₂.

2.2 Příprava antigen-specifických cytotoxických T lymfocytů
Příprava antigen-specifických cytotoxických T lymfocytů probíhala podle dříve publikovaného postupu⁽⁷⁾. Ve stručnosti, MN periferní krve, obsahující lymfocyty a antigen prezentující buňky byly v Den 0 stimulovány ozářenými MB v poměru 20:1 (MN:MB) a Den 7 restimulovány ozářenými MB v poměru 2:1 (MN:MB). Den 8 kultivace byly cytotoxické T lymfocyty (TL) aktivované MB identifikovány na základě produkce aktivačního markeru interferonu gamma (IFN-γ) pomocí dostupného kitu (Secretion Asay Cell Enrichment And Detection Kit, MACS Reagents, Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Německo). Magnetická separace se prováděla podle pokynů výrobce na koloně umístěné v magnetickém poli přístoje Vario MACS (MACS Reagens, Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Německo). IFN-γ pozitivní frakce byla získána dvojitou separací pro zvýšení čistoty. Specifické IFN-γ+ T lymfocyty byly dále expandovány v KM (5% CO₂, 37 °C) pomocí interleukinu 2 (IL-2, 500 IU /ml, Proleukin, Chiron, Amsterdam, Holandsko) a phytohemaglutininu (PHA, Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika), který byl přidán 1. den expanze v množství 5 g/ml KM. IL-2 byl přidáván 2-3x týdně, 1x týdně se prováděla výměna KM a byly přidávány alogenní MN jiného zdravého dárce ozářené dávkou 30Gy. Expanze probíhala po dobu 4-5 týdnů. Koncentrace buněk v KM byla 1x106/ml. Antigen specifické T lymfocyty od pacientů s melanomem byly získány expanzí tumor infiltrujících T lymfocytů.

2.3 Příprava buněk k cytotoxickému testu
Expandované T lymfocyty byly resuspendovány ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) v množství 1x106/ml a následně barveny CFSE o koncentraci 1 µM. T lymfocyty značené CFSE byly kultivovány s terčovými nádorovými buňkami ve smíšené in vitro kultuře v KM (5% CO₂, 37 °C) s IL-2 v množství 10 IU/ml KM, a to v poměrech (TL:MB) 2:1, 10:1 a 50:1 po dobu 4 hodiny, 24, 48 a 72 hodin.
K odlišení MB v pozdní apoptóze či nekróze byl použit 7-AAD a PI. Pro barvení 7-AAD bylo 0,5x106 buněk bylo inkubováno s 20 µl 0,005% 7-AAD 20 minut při pokojové teplotě. Poté byl přidán PBS a vzorky byly ihned analyzovány. Pro barvení PI byl ke vzorkům o buněčnosti 0,5x106 /ml přidán PI v koncentraci 1 µg/ml a po 5-10 minutové inkubaci při 4-8 °C byly vzorky v barvícím roztoku ihned analyzovány. Analýza probíhala na průtokovém cytometru Cytomics™ FC 500 (Beckman Coulter, Miami, Florida, USA) softwarem Cytomics RXP.

3. Výsledky
3.1 Optimalizace cytotoxického testu
Pro optimalizaci cytotoxického testu byly použity pro in vitro kultury poměry TL:MB 2:1, 10:1, 50:1. Cytotoxicita byla hodnocena po 4, 24, 48 a 72 hodinách kultivace. Po 4 hodinách kultivace byla cytotoxicita pro poměr 2:1 11,40%-38,88% (medián 21,78), pro poměr 10:1 18,07%-65,50% (medián 34,31) a pro poměr 50:1 27,20%-68,57% (medián 62,99). Při hodnocení po 24 hodinách kultivace byla cytotoxicity pro poměr 2:1 12,81%-73,14% (medián 60,84), pro poměr 10:1 38,04%-78,23% (medián 69,82).
V poměru 50:1 a také při hodnocení po 48 a 72 hodinách byla koncentrace terčových buněk velmi nízká (0,02% resp.0,67% a 0,62%), proto nebylo možné spolehlivé odlišení od přirozeného pozadí, test byl buď nehodnotitelný nebo vykazoval falešně negativní výsledky.

3.2 Ověření specificity expandovaných T lymfocytů
Myelom-specifický cytotoxický potenciál byl porovnáván s efektem myelom-nespecifických TL vůči MB a s efektem myelom-specifických TL vůči nespecifickému antigenu. Myelom-specifické TL byly kultivovány s alogenními monocyty zdravého dárce v poměrech 2:1 a 10:1. Cytotoxicita IFN-γ+ myelom-specifických TL vůči MB po 4 hodinách kultivace v poměru 2:1 a 10:1 byla 11,4%, resp.18,7%, po 24 hodinách 12,81% resp. 38,04%. Dále byly kultivovány IFN-γ– frakce TL s MB. IFN-γ– TL představují myelom-nespecifické TL, tedy takové, které neodpověděly na nádorový antigen aktivací spojenou s produkcí INF-γ a proliferací. V případě kultivace specifických TL s alogenními MN došlo k usmrcení 0,01% MN po 4 hodinách kultivace v poměru 2:1, 1,86% v poměru 10:1, po 24 hodinách v poměru 2:1 2,49%, v poměru 10:1 6,9%. Při kultivaci IFN-γ– TL s MB došlo k usmrcení 1,4% MB po 4 hodinách kultivace poměru 2:1, 0,82% MB v poměru 10:1, po 24 hodinách v poměru 2:1 0,28%, v poměru 10:1 0,83%.
Cytotoxický potenciál nádorově-specifických T lymfocytů byl dosud testován u jednoho pacienta s MM a jednoho s melanomem. U pacienta s MM činila cytotoxicita IFN-γ+ TL vůči MB po 24 hodinách inkubace 18,89%, přičemž vůči myelomové linii byla 18,22% a vůči alogenním MN 1,2%. IFN-γ– TL vykazovaly vůči autologním myelomových buňkám cytotoxicitu 5,7%. U pacienta s melanomem vykazovaly expandované TL cytotoxicitu vůči terčovým melanomovým buňkám po 4 hodinové inkubaci 33,33%, zatímco vůči myelomové linii ani vůči alogenním MN nebyl cytotoxický efekt vůbec zaznamenán.

4. Diskuze
V této práci prezentujeme zavedení cytometrického testu pro hodnocení cytotoxicity na bázi barevného označení efektorových buněk pomocí CFSE a barvení apoptotických a nekrotických buněk 7-AAD či PI ⁽⁴⁾. Metoda představuje výhodnější alternativu ve srovnání s klasickým testem s radioaktivním 51Cr z několika důvodů. Jsou to: 1.) užití neradioaktivních materiálů, které eliminuje nejen zdravotní rizika pro personál, ale též potíže spojené s požadavky na použití a likvidaci radioaktivního materiálu, 2.) CFSE je univerzální marker schopný označit jakoukoliv populaci sledovaných buněk, 3.) CFSE značení umožňuje současné použití monoklonálních protilátek proti povrchovým buněčným znakům a dovoluje tak bližší identifikaci jednotlivých subpopulací^{(8, 9, 10)}, 4.) CFSE značení je stabilní a použitelné i pro testy trvající několik dní, 5.) CFSE je v běžných barvících koncentracích netoxické, nemodifikuje lytické vlastnosti efektorových buněk^{(5, 6, 8)}. V našich experimentech byla použita koncentrace CFSE, která je v literatuře popisována jako bezpečná, tedy koncentrace, která neovlivňuje vitalitu a funkci značených buněk ^{(3, 5)}.
Navíc test s CFSE a s PI a 7AAD je senzitivnější než test s 51Cr zejména v nízkých poměrech efektorových a terčových buněk. Oproti tomu ve vysokém poměru efektorových:terčových buněk (50:1) se ukazují možné limitace testu, neboť nízká koncentrace terčových buněk nemusí vždy umožnit spolehlivé rozlišení od přirozeného pozadí, a tudíž může vést k falešně negativnímu výsledku. Proto je při použití tohoto testu nutné nejprve optimalizovat experimentální podmínky pro detekci lýzy terčových buněk.
Tato nová metoda současně dovoluje přesnou imunofenotypizaci tečových i efektorových buněk pomocí monoklonálních protilátek proti povrchovým antigenům ^{(8, 9)}, což je výhodné zejména v případě heterogenních buněčných populací⁽¹⁰⁾.
Takto zavedený test cytotoxicity je v současné době cenným nástrojem pro hodnocení efektorové složky imunitního systému a účinnosti protinádorových vakcín.

5. Závěr
V této práci demonstrujeme specifický cytotoxický efekt expandovaných interferon gama pozitivních T lymfocytů vůči buněčné myelomové linii ARH 77 či nádorovým myelomovým a melanomovým buňkám pacienta.

Literatura

1. Michálek J., Bü chler T., Hájek R.: T lymphocyte therapy of cancer, Physiol.Res. 2004, 53:463-469,
   
2. Shapiro H.M.: Practical flow cytometry, 4th Edition. John Wiley & Sons, Inc., Hooboken, New Persey, USA, 2003
   
3. Lyons A.B.: Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurment of CFSE dilution. J. Immunol. Methods 2000, 243(1-2): 147-52.
   
4. Marín L., Minguela A., Torio A., Moya-Quiles M.R., Muro M., Montes-Ares O., Parrado A., Alvares-Lopez D.M.R., GarcíaAlonso A.M.: Flow cytometric quantifitation of apoptosis and proliferation in mixe lymphocyte culture. Cytometry A 2003, 51(2):107-118
   
5. Sheehy M.E., McDermott A.B., Furlan S.N., Klenerman P., Nixon D.: A novel technique for the fluorometric assesment of T lymphocyte antigen specific lysis. J.Immunol.Methods 2001, 249(1-2): 219-20.
   
6. Lecoeur H., Février M., Garcia S., Riviére Y., Gougeon ML.: A novel flow cytometric assay for quantification and multiparametric characterisation of cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. Method 2001, 253 (1-2):177-87.
   
7. Očadlíková D., Kovářová L., Penka M., Žaloudík J., Bü chler T., Hájek R., Michálek J.: Identifikace nádorově-specifických T lymfocytů na základě produkce interferonu gama u mnohočetného myelomu. Klinická onkologie 2005, v tisku
   
8. Jedema I., van der Werff N., Barge R.M.Y., Willemze R., Falkenburg J.H.F.: A new CFSE based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor sells within a heterogenous target cell population. Blood 2004,103(7):2677-82
   
9. Godfrey W.R., Krampf M.R., Taylor P.A., Blazar B.R: Ex vivo depletion of alloreactive cells based on CFSE dye dilution, activation antigen selection, and dendritic cell stimulation. Blood 2004, 103(3): 1158-65.
   
10. Mannering S.I., Morris J.S, Jensen K.P., Purcell A.W., Honeyman M.C., van Endert P.M., Harrison L.C.: A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J.Immunol.Methods 2003,283(1-2):173-83

Tato práce byla částečně podpořena grantem GAČR 301/04/1387.