Význam exprese m RNA genu DD3PCA3 v tkáni pacientů s benigní hyperplázií prostaty a karcinomem prostaty

Klíčová slova: benigní hyperplázie prostaty (BPH), karcinom prostaty (PCa), DD3PCA3 (Differential Display Code 3 gen), prostatická intraepiteliální neoplázie (PIN), mRNA, RT-PCR (Reál Time - Polymerase Chain Reaction)

Cíl studie

Cílem studie bylo stanovení exprese mRNA genu DD3^PCA3 z tkáňových vzorků získaných z biopsií prostaty a provést korelace v závislosti na typu onemocnění. Ve skupině pacientů s karcinomem prostaty zjistit, zda-li míra exprese koreluje s rozsahem onemocnění (TNM) a biologickým charakterem karcinomu (Gleason skore)

Úvod

V minulosti bylo provedeno mnoho pokusů o zlepšení diagnostiky, léčby a predikce progrese onemocnění pacientů s karcinomem prostaty pomocí molekulárního stagingu. Důvodem je relativně nízká specifita, standardně stanovovaného markerů -PSA (prostatického specifického antigenů). V současnosti neexistuje jediný rutině stanovovaný molekulární parametr z prostatické tkáně. DNA analýza a proteomické metodiky dovolují virtuální virtuální systematickou analýzu všech genů, včetně genů typických pro karcinogenezi jak na DNA či RNA úrovni včetně detekce proteinů. Výzvou budoucnosti bude validizace potenciálních nádorových markerů na dostatečné skupině pacientů. Jako velice slibný genový marker detekce karcinomu prostaty se v současnosti jeví průkaz mRNA genu DD3^PCA3 (Differential Display Code 3 gen).

Materiál a soubor pacientů

Celkem bylo do studie 186 pacientů. Jejich nábor probíhal na dvou kooperujícíh pracovištích - Urologická klinika FN v Plzni a Urologická klinika 1. LF UK v Praze. Věkové rozložení pacientů bylo od 48 do 85 s mediánem 66.5 let. Rozložení do skupin bylo 86 pacientů s karcinomem prostaty resp. průkazem prekancerozy (PIN - prostatická intraepiteliální neoplázie) a 100 pacientů s histologicky prověřenou benigní hyperplázií. V rámci skupiny PCa bylo viděno 74 pacientů s prokázaným PCa a 12 pacientů s PIN.

Ve skupině pacientů PCa mělo 44 nemocných tumor lokalizovaný jen na prostatickou žlázu a zbylých 30 pacientů vykazovalo známky lokálně pokročilého či metastatického postižení.

Ve skupině pacientů PCa mělo 45 pacientů dobře až středně diferencovaný karcinom prostaty (gleason score 2-6) a 29 pacientů bylo nositeli špatně diferencovaného agresivního PCa (gleason score 7-10).

Míru exprese mRNA z tkáně jsme stanovovali pomocí RT-PCR. Reverzní transkripci jsme provedli pomocí enzymu Superscript III Reverse Transcriptase (Life Technologies, USA) Superscript III pracuje při vyšší teplotě (55°C) než Superscript II, který jsme používali dříve, což je lepší pro vyšší výtěžnost reakce. Jako primer pro RT jsme použili oligo d(T)21. Sekvenci primerů pro DD3^PCA3 a PSA jsme převzali z publikace publikace Bussemakerse a kol.. Amplifikace pro DD3^PCA3 však neprobíhala specificky, nezískali jsme produkt požadované délky 390 bp, proto jsme primery upravili a PCR již amplifikovala správný úsek -390 bp. Sekvence upravených primerů pro DD3^PCA3: forward primer: 5'-TGGTGGGAAGGACCTGATGATACAG-3' a reverse primer: 5'-TCTCCCAGGGATCTCTGTGCTTCC-3'. Fragmenty získané PCR jsme inzerovali do vektoru pGEM (Promega Corporation, USA) a klonovali. Klonované fragmenty DD3^PCA3 a PSA jsme použili jako standardy o známém počtu molekul. 1 \xl cDNAkaždého vzorku jsme použili pro real-time PCR na přístroji Rotorgene (Corbet Research, Australia). Stanovení DD3^PCA3 jsme prováděli pomocí firemního mastermixu: SuperMix Biorad, stanovení PSA fungovalo lépe s mastermixem, který jsme připravili z jednotlivých chemikálii, s polymerázou Hot Star od firmy ABgene. Všem stanovením předcházeli optimalizace všech kroků, které máme spolu s protokoly jednotlivých stanovení uloženy.

Pro stanovení amplifikace DNAjsme použili barvu SYBR Green I. Specifitu reakce jsme ověřili pomocí teplotní křivky tání a elektroforézy. Stanovení jsme provedli jako absolutní (počet molekul cDNA) a jako standardy jsme použili klonované fragmenty cDNA. Výsledky jsou uváděny jako:

• Hodnoty Ct - hodnoty cyklu, v kterím dojde ke křížení s přímkou threshholdu, čím je hodnota nižší, tím vyšší je množství kopií. Výsledky jsme hodnotili zvlášť pro DD3 (Ct) a PSA (Ct).
• Normalizované hodnoty - výsledky jsou uváděny jako poměr sledovaného genu a PSA (DD3^PCA3/PSA).

Výsledky

Prokázali jsme, že hladina exprese mRNA pro DD3^PCA3 (Ct) byla signifikantně vyšší (p<0.045) ve skupině pacientů s PCa než u nemocných s BPH (viz. tab 1). Taktéž jsme nalezli statisticky významný rozdíl v hladině exprese mRNA mezi pacienty s BPH a pacienty s PIN (p<0.023) (viz. tab 2.) Při sledování korelace mezi TNM stádiem (na žlázu ohraničený PCa vs. pokročilý či metastatický PCa) a exprese DD3^PCA3 a PSA mRNA jsme v tomto ohledu nenašli signikatní souvislosti (viz. tab. 3). Stejný závěr jsme učinili u srovnání skupin pacientů s Gleason score 0-6 oproti špatně diferencovaným tumorům s Gleason score 7-10. Ani zde nebyla prokázána korelace mezi biologickou aktivitou tumoru a expresí DD3^PCA3 a PSA mRNA (viz. tab. 4.).

Posledním srovnáním bylo stanovení hladiny DD3^PCA3 and PSA mRNA exprese u pacientů s BPH a PIN. Zde jsme zaznamenali statisticky významný rozdíl (p<0.0141) mezi zmíněnými skupinami. Paradoxně ale byla hladina exprese mRNApro DD3^PCA3 (Cť) vyšší u pacientů s BPH (viz. tab. 5)

Závěr

Exprese genu DD3^PCA3 v tkáni je statisticky signigikantně vyšší u tkáně postižené karcinomem než u pacientů s BPH. Tento nález s ohledem na orgánovou specificitu DD3^PCA3 v kombinaci se stanovením hladiny PSA může zpřesnit indikaci a časnou diagnostiku karcinomu prostaty. Dalším potencionálním využitím je časná indikace rebiopsií u pacientů s histologicky negativním nálezem a zvýšenou expresí DD3^PCA3 ve tkáni odebraného vzorku při přetrvávající elevaci PSA. Exprese genu DD3^PCA3 v tkáni nebude do budoucna pravděpodobně použitelná jako prognostický marker pro stanovení strategie léčby.

Adresa pro korespondenci: MUDr. Jiří Klečka, Ph.D., Urologická klinika FN v Plzni, Tř. E. Beneše 13, 305 99, Plzeň; e-mail: kleckaj@fnplzen.cz

Tato práce byla podpořena grantem IGA NR8918-3. Práce byla podpořena výzkumným záměrem MSM 0021620819. Náhrada a podpora funkce některých životně důležitých orgánů.