Vývoj laboratorních vyšetřovacích metod v diagnostice genů BRCA1 a BRCA2 v MOÚ.

Molekulárně genetická laboratoř, která je součástí Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů v Masarykově onkologickém ústavu, byla založena v roce 1999. Za 11 let její činnosti došlo k významnému rozšíření diagnostiky o řadu nádorově predispozičních genů, soustavnému nárůstu požadavků na vyšetření a výraznému rozvoji a modernizaci laboratorních vyšetřovacích metod.

V současné době se zabývá laboratoř nejen mutační analýzou genů BRCA1 a BRCA2, ale také jinými geny způsobujícími dědičnou formu nádorových onemocnění, jako TP53 – hereditární syndrom Li-Fraumeni, Lynchův syndrom – mutační analýza genů MLH1, MSH2, MSH6, hereditární syndrom familiárního melanomu – CDKN2A, hereditární syndrom difúzního karcinomu žaludku – CDH1, vyšetření populačně nejčastějších mutací v genu CHEK2 – multiorgánová nádorová predispozice.

BRCA1 a BRCA2 jsou geny, jejichž mutace způsobují zvýšené riziko vzniku různých malignit, především však karcinomu prsu a/ nebo ovarií. Celoživotní riziko vzniku karcinomu se u nosiček mutace pohybuje v rozmezí 40-85%.

BRCA1 gen je lokalizován na chromozomu 17q12-21, je složen z 24 exonů. Kódujících je 22 exonů, které jsou překládány do proteinu o 1863 aminokyselinách. BRCA2 gen je lokalizován na chromozomu 13q12-13, je složen z 27 exonů. Kódujících je 26 exonů, které jsou překládány do proteinu o 3418 aminokyselinách. Geny jsou součástí multiproteinových komplexů, které udržují stabilitu genomu, účastní se homologní rekombinace a DNA reparačních mechanizmů, regulace buněčného cyklu, regulace transkripce, podílí se na lokálních změnách struktury chromatinu.

Ke screeningovému vyšetření těchto genů byly používány vertikální i horizontální elektroforetické metody vycházející z PCR reakce. Pro exony o velikosti cca 200-500 bp to byla metoda heteroduplexní analýzy, pro exony s větším počtem bp (BRCA1 exon 11, BRCA2 exon 10,11) metoda PTT – Protein Truncation Test.

Heteroduplexní analýza je metoda, při které se detekuje hybridní dvoušroubovicová molekula DNA, jejíž řetězce pocházející z různých rodičovských alel a vyznačují se neúplnou komplementaritou. Citlivost metody je 100% pro drobné delece a duplikace a 70-80% pro substituce, je časově náročná a vyžaduje velkou zkušenost hodnotícího pracovníka – hodnotí se vizuelně.

Protein Truncation Test je metoda, při které se využívá in vitro transkripce a translace, kdy mutace způsobuje předčasné zastavení translace. Detekce se provádí na úrovni proteinů a lze detekovat pouze delece, duplikace a nonsense mutace. Je to metoda náročná na čas i zkušenosti hodnotícího pracovníka, hodnotí se také vizuelně.

Pro limitovanou senzitivitu a časovou náročnost byly tyto metody v roce 2007 nahrazeny vysokorozlišovací analýzou křivek tání (HRM – High Resolution Melting) s využitím přístroje LightScanner (Idaho Tech.).

Je to vysoce senzitivní, rychlá metoda využívaná k záchytu různých mutací v krátkých fragmentech DNA v heterozygotním stavu. Je založená na principu heteroduplexní analýzy.

Analýza využívá vlastností fluorescenční barvy, která během PCR reakce inkorporuje do dvouřetězcové DNA. Během postupného zahřívání dochází k denaturaci (meltingu) DNA a barva se z jednořetězců uvolňuje, což se projevuje poklesem fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném fragmentu DNA výrazně mění profil křivky meltingu. Tato metoda umožňuje ve většině případů přesné rozlišení různých variant a mutací lokalizovaných v analyzovaném fragmentu a mnohdy i zachycení homozygotní varianty polymorfních oblastí. Záchyt heterozygotního stavu je u metody HRM téměř 100% pro PCR fragmenty s délkou v rozmezí cca 100-500bp. Analytický program umožňuje prohlížení křivek tání a identifikaci rozdílných profilů a jejich správné vyhodnocení.

Metodou pro stanovení sekvence (pořadí jednotlivých bází) analyzovaného fragmentu je přímé sekvenování. Používá se k charakterizaci pozice a typu mutací u genetických onemocnění. Všechny fragmenty s aberantní mobilitou zachycené metodami HA, PTT a v současné době HRM jsou sekvenovány. K tomuto účelu byl od r. 2000 používán automatický gelový sekvenátor ALF express II (Pharmacia). Tato metoda byla časově velmi náročná, v jednom běhu bylo analyzováno pouze 10 vzorků DNA i příprava vzorků k sekvenování byla pracná. Od roku 2007 byl gelový sekvenátor nahrazen čtyřkapilárním automatickým sekvenátorem Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems).

Sekvenování je méně pracné, za 24 hod. je možno analyzovat až 96 vzorků. Při automatickém sekvenování jsou do PCR produktů začleněny fluorescenční značky pomocí značených terminátorů. Genetický analyzátor detekuje fluorescenci ze 4 různých fluorescenčních barev, které se používají k identifikaci bazí A, C, G, T.

Další metodou, která byla zavedena pro zvýšení senzitivity a spektra detekovaných mutací o velká intragenová přeskupení je metoda MLPA – Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, kterou provádíme od roku 2005. Její podstatou je hybridizace speciálně navržených sond specifických pro jednotlivé exony daného genu s genomovou DNA, jejich ligace a následná multiplex PCR reakce. Pro analýzu používáme komerčně dostupné kity firmy M.R.C. Holland.

Zavedení nových moderních metod vedlo k výraznému zvýšení senzitivity a specifity vyšetření, umožnilo celkové urychlení vyšetřovacích postupů a tím i navýšení kapacitních možností laboratoře. Do konce roku 2010 bylo testováno v naší laboratoři již 2850 vysoce rizikových rodin s podezřením na hereditární syndrom nádoru prsu a ovária, kauzální mutace v genech BRCA1 a BRCA2 byla zachycena u 720 rodin. Z těchto rodin bylo prediktivně testováno 1780 příbuzných.

Genetické testování je podpořeno grantem MZO MOU 2005