Využití tumor infiltrujících lymfocytů (TIL) u pacientů s metastazujícím melanomem - klinické sledování aplikace u prvního pacienta v ČR

Maligní melanom ve fázi generalizovaných metastáz je považován zajedno z nejhůře ovlivnitelných nádorových onemocnění. V případě chirurgicky neřešitelné generalizace melanomu není v současných možnostech onkologické léčby dosáhnout kurativního efektu léčby (1). Onemocnění je považováno za chemorezistentní i radiorezistentní (2). Metastázující melanom (MM) je však také zároveň považován za imunogenní nádor (1,3). Stav imunitního systému je intenzívně studován u pacientů s MM po několik desetiletí a v posledních letech se objevují klinické studie využívající adoptivní imunoterapie (3,4). Adoptivní buněčná imunoterapie u nádorových onemocnění (zejména u MM) představuje novou terapeutickou strategii založenou na aktivaci imunitního systému prakticky bez vedlejších nežádoucích účinků. Je definována jako převod buněk imunitního systému s protinádorovou aktivitou, v tomto případě tumor-infiltrujících lymfocytů (TIL), pacientovi s cílem dosáhnout léčebné odpovědi. Zdůvodnění takového postupu se opírá o fakt, že melanomy jsou velmi často infiltrovány cytotoxickými (Tc) nebo pomocnými (Th) lymfocyty, které mají schopnost cíleně rozpoznat nádorově specifické antigeny a eliminovat nádorové buňky. Lidské TIL je nejprve nutné namnožit in vitro, přičemž po 5-8 týdenní expanzi na řádově 1010 buněk, přibližně u 50% pacientů s melanomem byl prokázán specifický cytotoxický potenciál in vitro expandovaných TIL (5,6). Klinická odpověď pak byla zaznamenána u 35-50% pacientů po podání TIL v kombinaci s IL-2 v nízkém dávkování. To představuje jen malou zátěž pro pacienta a zároveň je dostatečné k udržení vitálních TIL i po několik týdnů po jejich infúzi, kdy tumor-specifické T lymfocyty se přednostně kumulují v nádorové tkáni a perzistují v periferní krvi několik týdnů (7-9).

I přes tyto úspěchy adoptivního transferu T lymfocytů existují četné překážky, které brání likvidaci nádorových buněk in vivo.

V posledních 5 letech je velká pozornost věnována imunoregulačním T lymfocytům (CD4+CD25+FoxP3+), které mohou navodit stav anergie - snížené reaktivity vlastního imunitního systému vůči nádorovým buňkám (10). Stav anergie lze do určité míry zvrátit použitím vysokodávkované chemoterapie, která vede k přechodné imunoablaci, tedy dočasnému poklesu počtu lymfocytů v periferní krvi. Tento postup však rovněž zvyšuje riziko myelotoxicity a přispívá ke zvýšení morbidity a mortality. Z tohoto důvodu se hledají cesty, jak zmírnit myelotoxicitu a přitom zachovat imunoablativní účinek, který eliminuje především populaci imunoregulačních lymfocytů. Jedním z možných přistupuje využití analogů purinových nukleosidů (11), např. fludarabinu.
Ten je součástí nemyeloablativních lymfoablativních transplantačních režimů (12). Vzhledem k širokému používání fludarabinu existuje dostatečná klinická zkušenost s jeho aplikací, zejména je využívána jeho schopnost imunoablace s minimální myelotoxicitou ve srovnání s jinými cytostatiky (11,12).

V rámci předchozí spolupráce Univerzitního centra buněčné imunoterapie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) byla otestována příprava TIL v podmínkách čistých výrobních prostor (jediných na akademické půdě určených pro přípravky buněčné imunoterapie v ČR, které jsou akreditovány Státním ústavem pro kontrolu léčiv). Po tomto preklinickém výzkumu expanze TIL a dalších lymfocytů s protinádorovou aktivitou in vitro (13-15), jsme v roce 2008 po schválení etickou komisí MOÚ přistoupili k vlastní klinické studii na pacientech, která poprvé v ČR a ve střední Evropě umožňuje klinickou aplikaci přípravku TIL jako relativně bezpečné experimentální léčebné metody progredujícího MM, který nereaguje na konvenční léčbu. Cílem této studie je příprava a podání autologních TIL po předchozí imunoablaci fludarabinem u 12 pacientů s MM, specifické cíle jsou pak následující:

1. Primárním cílem klinické studie fáze I/II je zhodnocení toxicity podávaného režimu imunoablativní chemoterapie následované podáním preparátu TIL u pacientů s MM.
   
2. Sekundárními cíli této studie jsou
   
   • zhodnocení imunitní odpovědi po podání autologních TIL;
   • 
     
   • zhodnocení klinické odpovědi po podání autologních TIL u pacientů s MM.

Do studie jsou zařazováni nově diagnostikovaní pacienti s lokoregionálním onemocněním (stadium III) nebo generalizovaným onemocněním (stadium IV). Každý pacient je zařazen na základě podpisu informovaného souhlasu a ověření vstupních a vylučovacích kritérií zadaných v klinickém protokolu. Pacient nejprve podstoupí chirurgický zákrok sloužící k histopatologickému stanovení diagnózy metastázujícího melanomu z nádorem infiltrované uzliny bohaté na lymfocyty. Na základě potvrzení přítomnosti nádorové infiltrace ve vyjmuté tkáni patologem (v den operace, Den - 60 studie) je přistoupeno k její in vitro kultivaci v kompletním kultivačním médiu bohatém na IL-2. Expanze lymfocytů in vitro probíhá až do dosažení množství 109-1010 vitálních buněk TIL v průběhu 5-8 týdenní kultivace, buňky jsou vyšetřeny z hlediska kvality a bezpečnosti a zamrazeny ve 3 identických sterilních vacích. Po zhojení operační rány je přistoupeno k chemoterapii dakarbazinem, zpravidla 10 dní po operaci, nejdéle však 14 dní po operaci (Den -50). Jedná se o standardní postup léčby IV klinického stadia metastázujícího melano¬mu. U pacientů v III. klinickém stadiu následuje standardní adjuvantní podávání interferonu alfa po dobu jednoho roku. Objeví-li se progrese onemocnění u této vysoce rizikové skupiny pacientů, vyžadující systémovou léčbu, bude tato aplikována stejně jako u IV klinického stadia. Po kontrole dostatečného množství expandovaných TIL je přistoupeno k podání imunoablativní chemoterapie fludarabinem (Den -5 až -1). Následně je v Den 0 podána po rozmražení první infúze TIL doplněná podáním IL-2 s.c. po dobu 42 dní. Další infúze TIL následují v Den 14 a v Den 28 a pacient je pravidelně sledován v průběhu 6 měsíců ode Dne 0. V tomto období pacient nedostává žádnou jinou protinádorovou léčbu.

V současné době (leden 2009) proběhla úspěšně aplikace 3 infúzi TIL prvnímu pacientovi s MM. Odběr uzlinové metastázy byl proveden v září 2008, po 8-týdenní kultivaci bylo získáno 1,04x1010 TIL, které byly pacientovi nitrožilně aplikovány ve 3 krátkodobých infúzích. Dosavadní sledování výše uvedených cílů je možné hodnotit následovně:

Toxicita podaného přípravku. Po aplikaci každé jednotlivé infúze nebyly pozorovány žádné závažné nežádoucí účinky, pouze byly pozorovány subfebrilie, a po prvních 2 aplikacích mírné bolesti hlavy stupně 1 dle klasifikace WHO pravděpodobně v souvislosti s přítomností zamražovací směsi obsahující DMSO v podané infúzi. Jiné nežádoucí účinky nebyly za dosud sledované období (2 měsíce od první podané infúze TIL) pozorovány. Bedlivé monitorování vnitřního prostředí nevykazovalo odchylky od referenčních mezí s výjimkou přechodné očekávané lymfopenie po podání fludarabinu, bez klinických projevů.

Imunitní odpovědi podaného přípravku. Hodnoty krevního obrazu se před a během léčebného režimu nacházely v normě s výjimkou zmiňované přechodné lymfopenie. Byl sledován vývoj vybraných populací, především T lymfocytů pomocných (Th) CD3+CD4+, cytotoxických (Tc) CD3+CD8+, T-lymfocytů regulačních (Treg) CD4+CD25+FoxP3+, centrálně paměťových (Tem) CD27+CD45R0+ a efektorově paměťových (Tem) CD27-CD45R0+. Je patrné, že imunoablace fludarabinem vede k výraznému poklesu všech těchto populací. Již po první infúzi TIL však dochází k dramatickému nárůstu zejména žádoucích Tem a Tem, který dosahuje více než dvojnásobku původních hodnot před lymfoablační chemoterapií. Dochází také k rychlému obnovení Th a Tc lymfocytů. Bohužel dochází také k částečnému nárůstu Treg, které mohou mít imunosupresívní efekt.

Klinická odpověď podaného přípravku. Před odběrem metastázy bylo provedeno PET/CT s rozsáhlým nálezem - metastatického postižení lymfatických uzlin na obou stranách krku, pleury a jater. Pro zhodnocení klinické odpovědi na imunoterapii budou tyto výsledky porovnány s novými vyšetřeními pomocí PET/CT po 3 a 6 měsících od podání první infúze TIL.

Na základě předchozích zkušeností předpokládáme, že podání TIL může vést k podstatnému zlepšení kvality života pacientů s MM, zejména skýtá reálný předpoklad oddálení progrese choroby, což nabývá na významu ve fázi choroby, která je standardními léčebnými postupy minimálně ovlivnitelná. Nezanedbatelný je rovněž ekonomický aspekt studie včetně minimalizace nežádoucích vedlejších účinků při využití imunoterapeutického přístupu s podáním expandovaných aktivovaných autologních T lymfocytů.

Literatura

1. Greenberg PD., Adv Immunol 1991, 49: 281-9.
   
2. DeVita VT, et al., Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia 2001: 2003-2069.
   
3. Michálek J., Svoboda M., Klinická onkologie, 2003, 16: 145-148.
   
4. Bach JE, Nature Rev Immunol 2003, 3: 189-98.
   
5. Kirkwood JM, Agarwala S., PPO Updates 1993, 7: 1-28.
   
6. Rosenberg SA., Nature 2001, 411: 380-6.
   
7. Dighiero G., Hematol Cell Ther 1996, 38, Suppl 2: S75-81.
   
8. Takada K, et al., Ann Rheum Dis 2003, 62: 1112-5.
   
9. Yee C, et al., Proč Nati Acad Sci USA 2002, 99: 16168-73.
   
10. Dreno B, et al., Cancer Immunol Immunother 2002, 51: 539-46.
    
11. NCI CTC verse 2.0, www.eortc.be/services
    
12. Therasse P, et al., J Nati Cancer Inst 2000, 92: 205-17.
    
13. Ocadlikova D, et al., Med Oncol 2006, 23: 377-84.
    
14. Michálek L, Kocák I., Fait V., Žaloudík L, Hájek R., J Immunol 2007, 178: 6789-6795.
    
15. Michálek J., Matějková E., Smejkalová J., Hanák L., Vidláková P, Stejskalová A., Kocák I., Fait V., Klin. onkologie 2007, 20,4,298-301.

Tato práce byla částečně podporována grantem MSMT NPVII2B06058 a nadačním fondem Modrá kotva.