VYUŽITÍ NGS PŘI DIAGNOSTICE DĚDIČNÉ NÁDOROVÉ PREDISPOZICE

Východiska:

Testování alternativních postupů pro zpracování vzorků, zjištění senzitivity a nastavení vnitřní kontroly kvality pro využití NGS v diagnostice nádorové predispozice.

Materiál a metody:

1)testování senzitivity NGS pro záchyt různých typů mutací v genech BRCA, 1a) PCR amplifikace kódující sekvence genů BRCA1 a BRCA2 pomocí primerů používaných v OEGN laboratoři, testování 48 BRCA mutací, příprava knihovny, 1b) využití kitu Multiplicom pro BRCA (multiplex amplifikace) testování 12 mutací, příprava knihovny. 2) TruSight Cancer Target Genes (Illumina) – tagmentace genomické DNA, enrichment/ hybridizační postup sekvenace 94 genů (tumor supresové geny, reparační geny, protoonkogeny) – analýza 4 pacientů s vysoce rizikovou osobní a rodinnou anamnézou bez detekované mutace v genech TP53, CDKN2A, BRCA, HNPCC geny – dle OA a RA. Sekvenování na na MiSeq (Illumina), bioinformatická analýza dat, ověření nově detekovaných patogenních mutací standardními metodami a interpretace výsledků.

Výsledky:

1a) U některých úseků (vzorků) analyzovaných PCR fragmentů se nepodařilo dosáhnout požadované hloubky sekvenování, v důsledku čehož bylo zachyceno pouze 46% mutací (pokrytí 100+) a 67% mutací (pokrytí 10+). Záchytnost testovaných mutací (bodové záměny až po duplikaci 64 bází) byla ovlivněna velkými rozdíly v zastoupení pokrytí u jednotlivě amplifikovaných fragmentů. Obtížně zachytitelné byly rozsáhlé delece/ inzerce. 1b) Multiplex amplifikace s využitím kitu Multiplicom odstranila problémy s nerovnoměrným pokrytím jednotlivých úseků a bylo zachyceno všech 12 testovaných mutací. 2) V pilotní studii TruSight Cancer Target Genes byly zachyceny terminální mutace, které jsou s vysokou pravděpodobností příčinou nádorové predispozice u 2 analyzovaných pacientů: patogenní mutace v genu BAP1 byla zachycena u ženy (*1985) s RA maligní mezoteliom (45), melanom oka (22) a nádor slinivky (45). Patogenní mutace v genu ATM (v PI3K doméně, postihující kinázovou aktivitu ATM) a v genu FANCA (asociovaná s projevy Fanconiho anémie) byla zachycena u muže s rabdomyosarkomem pánve v 7 letech a Grawitzovým tumorem v 31 letech, u jehož příbuzných byly mezi 45. a 55. rokem diagnostikovány nádory ledvin (2krát), kolorektální karcinom a nádor slinivky.

Závěr:

NGS umožňuje významné rozšíření spektra analyzovaných genů, což představuje výzvu pro zajištění odpovídajícího preventivního sledování a léčebných postupů u osob v riziku.

Práce byla podpořena MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805); CEITEC – Central European Institute of Technology CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0068; OP VK SuPReMMe CZ.1.07/ 2.3.00/ 20.0045.