Využití molekulárních metod v bioptické a prediktivní diagnostice maligního melanomu z pohledu patologa.

   Maligní melanom je zhoubný novotvar, který je odvozen od pigmentových buněk derivovaných z neurální lišty, s nejrychleji vzrůstající incidencí na světě. Na tento novotvar se z pohledu patologa můžeme dívat ze dvou hledisek. Prvním je složitost bioptické diagnostiky tohoto novotvaru a druhým možnosti prediktivní patologie s ohledem na volbu vhodné terapie. V obou případech mohou pomoci metody molekulární patologie (cytogenetika, molekulární biologie).

    V bioptické diagnostice je velice důležité odlišení benigních melanocytárních lézí od maligního melanomu. Zde se jeví jako užitečná pomocná metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Díky této metodě můžeme sledovat zmnožení nebo ztráty specifických chromozomálních oblastí. Nejčastěji lze sledovat delece v regionech 6q, 8p, 9p, 10q. Dále jsou časté amplifikace v regionech 1q, 6p, 8q, 17q, 20q. Udává se také zmnožení celého chromozomu 7. Máme k dispozici kombinované sondy Vysis LSI RREB1/LSI Myb/LSI CCND1/CEP6 (fluorescenčně značené, pro odečítání ve fluorescenčním mikroskopu) (Abbott Molecular, USA), které lze použít k detekci numerických změn vyskytujících se u maligních melanomů a tím doplnit/potvrdit diagnózu.

   V rámci prediktivní patologie a s rozvojem personalisované medicíny se otevírají i nové možnosti terapie. U maligního mel nomu lze sledovat několik biomarkerů. Jako jeden z nejvýznamnějších se jeví gen BRAF. Gen BRAF je lokalizovaný v chrom zomálním regionu 7q34, skládá se z 18 exonů a délka transkribované mRNA je 2478 bp. Pro klinické využití se prováděly test ce na exonech 1, 2 a 15. Aktivující mutace tohoto protoonkogenu se objevují u mnoha karcinomů, včetně maligního melanomu. Mutace byly detekovány u 40 % maligních melanomů. U benigních melanocytárních lézí se tato mutace vyskytuje zcela běžně. Ke většině mutací dochází na kodonu 600. Rutinně se testuje mutace V600E. Na tomto kodonu je 80 % mutací způsobeno transverzí T1799A, která vede k aminokyselinové záměně V600E. Mutace V600E propůjčuje buňkám transformační aktivitu, protože stimuluje fosforylaci na T599 a/nebo S602 v aktivační doméně proteinu BRAF. Ve zdravých buňkách je BRAF součástí signální dráhy receptorů pro růstové faktory. Onkogenické mutace genu BRAF mají za následek aktivaci kinázy, což vede k aktiv ci dráhy i při nepřítomnosti růstového faktoru. Tuto aktivaci lze inhibovat novým inhibitorem PLX4032 (Plexxikon, RG7204, Roche), který je cílený na mutaci BRAFV600E. Pro detekci aktivujících mutací genu BRAF používáme řadu metod: BRAF – izolace a amplifikace DNA pro hybridizaci na stripy BRAF StripAssay (ViennaLab) nebo přímé detekce v reálném čase Real Time PCR cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test (Roche). Kontra indikaci může navodit ovšem další mutace a to genu KRAS, např. RASG12D. Aktivovaný RAS spouští kaskádu proteinových serin/threoninových kináz. Pro detekci inhibujících mutací genu KRAS používáme KRAS – Thera Screen mutation kit (Roche) a cobas KRAS Mutation Test (Roche). Oba kity jak pro BRAF tak i KRAS vykazují vysokou specifičnost, robustnost a dobrou reprodukovatelnost.

   Dalším diskutovaným biomarkerem je gen CEACAM1 známý také jako CD66a. Tento gen je z rodiny genů patřících do podskupiny imunoglobulinů a je umístěn na dlouhém raménku chromozomu 17. Hraje klíčovou úlohu v imunologických procesech a byl původně identifikován jako tumorsupresorový gen. Dle studií významně koreluje s progresí tumoru a se špatným přežitím pacientů. O jeho významu jako biomarkeru pro volbu terapie se stále diskutuje.

   Z hereditárního hlediska se u maligních melanomů sledují také mutace genu CDKN2A (cyklin dependentní inhibitor kinázy 2A) s transkripčními variantami p16/ INK4a a p14/ARF. Tento gen je lokalizovaný na chromozomu 9 (9p21). Mutace narušují regulaci ústřední dráhy buněčného cyklu. Tyto mutace lze rutinně detekovat přímou sekvenací.

   Na závěr lze konstatovat, že patolog má dnes možnost využívat rutinní molekulární metody v rámci bioptické diagnostiky jako pomocné metody při stanovení biologické povahy melanocytárních lézí, může je však také využít v rámci prediktivní patologie při stanovení vhodné léčby.