VYUŽITÍ METODY SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS) K ANALÝZE MUTAČNÍHO STAVU ČLENŮ EGFR SIGNÁLNÍ DRÁHY U PACIENTŮ S METASTATICKÝM KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM (MCRC) LÉČENÝCH CETUXIMABEM

Východiska:

Cílená léčba monoklonálními protilátkami proti EGFR je významnou terapeutickou alternativou u pacientů s mCRC. K regresi nádoru však dojde jen u části léčených pacientů, a proto jsou vyvíjeny intenzivní snahy o nalezení prediktorů odpovědi či rezistence k této terapii. V klinické praxi se v současné době používá stanovení mutací onkogenů z rodiny RAS (přítomná u cca 50 % pacientů), které predikují rezistenci k anti-EGFR léčbě. Kromě toho však existuje řada dalších prediktorů (mutace BRAF, PIK3CA, PTEN, hladina kopií genu pro EGFR, hladina exprese ligandů EGFR epiregulinu a amphiregulinu a další), které odpověď na anti-EGFR terapii ovlivňují.

Cíl:

Projekt využívá nové vysokokapacitní technologie NGS k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s mCRC léčených cetuximabem, kteří na léčbu neodpověděli ani přes ověřenou absenci mutace v onkogenu RAS. Vyšetřeny byly nádorové buňky primárních tumorů i metastáz a byly hledány rozdíly v mutačním stavu mezi oběma lokalitami a další faktory, které jsou za rezistenci terapie odpovědné. K vyšetření byl použit komerční TruSight Tumor panel (Illumina), který je určen k přípravě DNA knihovny pro následné NGS na platformě MiSeq. Panel obsahuje 26 genů s biologickým významem u solidních nádorů.

Závěr:

Bylo vybráno 13 pacientů léčených cetuximabem pro mCRC s vyloučenou mutací onkogenu RAS. Devět z těchto 13 pacientů na anti-EGFR léčbu vůbec neodpovědělo, naopak zbývající čtyři pacienti dosáhli léčbou kompletní nebo parciální remise. Byly vyhledány vzorky operovaných primárních tumorů a metastáz, patolog vyhodnotil procentuální zastoupení nádorových buněk a označil vhodné části k molekulárnímu testování. Bylo izolováno celkem 26 DNA. U všech vzorků DNA byla spektrofotometricky změřena koncentrace a čistota, následně byla ověřena amplifikovatelnost DNA metodou RQ-PCR. Poté byla připravena DNA knihovna a zahájeno vlastní sekvenování. U čtyř z devíti progredujících pacientů byla zjištěna nová mutace v onkogenu KRAS, kterou v té době používané testy nezachytily: ve dvou případech se jednalo o selhání metody Therascreen, přičemž později používaný test Cobas by danou mutaci již zachytil, v dalších dvou případech by však nová mutace KRAS nebyla zachycena ani zmiňovaným testem Cobas. Nově zjištěné mutace přitom prokazatelně vedly k selhání anti-EGFR léčby. Z uvedeného jednoznačně vyplývá, jak důležité je hodnotit výsledky klinických studií z pohledu senzitivity v té době používaných diagnostických metod.

Práce byla podpořena grantovým projektem MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).