Využití magnetizovatelných částic v kombinaci s elektrochemickou detekcí.

Více jako 45 let je známo, že je možné nukleové kyseliny analyzovat pomocí elektrochemických metod. Význam této detekce stále narůstá především v souvislosti s výrazným rozvojem čipových technologií a stále hlubších znalostí v oblasti struktury genomu. Je známo, že DNA poskytuje na rtuťové elektrodě redukční signál adeninu a cytosinu kolem potenciálu -1,4 V a oxidační signál redukčního produktu guaninu kolem potenciálu -0,2 V. Navíc od konce osmdesátých let minulého stolení byly pozorovány oxidační signály adeninu a guaninu na uhlíkové elektrodě. Proto byla velkým překvapením zpráva o možnosti rozlišit na uhlíkových elektrodách jednotlivé báze (adenin, cytozin, guanin i thymin). V naší práci jsme se zaměřili na charakterizaci DNA na uhlíkové pastové elektrodě. Zjistili jsme, že jsme schopni rozlišit všechny báze nukleové kyseliny s limitem stanovení kolem 3 µg/ml. Navrženou technikou byly sledovány interakce DNA s vybranými rostlinnými antioxidanty. Navíc byla celá technika stanovení DNA přesunuta do roviny mikrostanovení na miniaturizovaných tištěných elektrodách při amperometrickém způsobu rozlišení analytu. Všechny tyto nástroje bylo možné využít jako detekční krok v izolaci DNA na povrchu magnetizovatelných částic. Velmi vhodné jsou paramagnetické částice (DBT), které mají na svém povrchu ukotvený řetězec T(25). Molekuly mRNA (obsahují vždy sekvenci A25) interagují s řetězcem T(25) navázaným na DBT. Pro zvýšení reprodukovatelnosti zachycení nukleových kyselin na povrch magnetizovatelných částic byl navržen automatizovaný způsob využívající spojení vortexování a centrifugace v jednom přesně programovatelném cyklu. Výtěžnost izolace DNA se pohybovala mezi 60-80%. Z izolovaných DNA o různé koncentraci byla získána lineární závislost s rovnicí regrese y = 0.7,41x + 0,13 s koeficientem spolehlivosti R2=0,9989. Celý postup byl následně uplatněn pro analýze reálných vzorků tkání.

Práce byla podporována grantovými výzkumnými projekty Běh Terryho Foxe 2007 a GA AV IAA401990701.

• KIZEK, R., et al.: Voltammetry of two single-stranded isomeric end-labeled -SH deoxyoligonucleotides on mercury electrodes.
  
• Talanta, 56, 2002 (5), s. 915-918.
• 
  KIZEK, R., et al.: Determination of nanogram quantities of osmium-labeled single stranded DNA by differential pulse stripping voltammetry. Bioelectrochemistry, 55, 2002 (1-2), s. 119-121.