Využití laserové mikrodisekce v nádorové diagnostice pro extrakci a lineární amplifikaci DNA z jednotlivých buněk.

Mikrodisekce byla vyvinuta na základě spolupráce mezi skupinou bioinženýrů (Arctus Engineering, Inc.; Mountain View, AC: www.arctur.com) a skupinou zabývající se výzkumem rakoviny v NIH (Bethesda) v roce 1996. Laserová mikrodisekce (LCM) je rychlá a spolehlivá metoda která umožňuje isolaci cílových buněk ze specifického komplexu tkáně pro jejich následnou molekulární nebo proteinovou analýzu. Základem LCM je inverzní mikroskop se zabudovaným nízko výkonnostním infračerveným laserem. Nařezané tkáně jsou upevněny na standardní podložní sklíčko a termoplastická membrána je umístěna nad dehydratovaný preparát. Ohniskem laserového mikroskopu se aktivuje termoplastická membrána která je navázána k identifikované cílové buňce v mikroskopované části preparátu. Laser roztaví termoplastickou fólii v daném místě, kde je navázaná cílová buňka. Laserová mikrodisekce byla použita pro izolaci buněk u řady typů buněčných i tkáňových preparátů, včetně zamražených vzorků, formalínem fixovaných, parafinizovaných tkání či cytologických preparátů. V závislosti na použitém materiálu z mikrodisekovaných buněk je možno extrahovat DNA, mRNA či proteiny v dobré kvalitě. Kombinací s dalšími technikami, jako například cDNA microaarays, by LCM měla pomoci identifikovat nové diagnostické a prognostické markery vedoucí ke zlepšení diagnosticko terapeutických metod v léčbě onkologických onemocnění.
Laserovou mikrodisekcí byly isolovány na našem pracovišti buňky z cytologických preparátů adneokarcinomu plic získaných punkční cytologií (barveno metodou Giemsa-Romanowski), zamražených či parafinizovaných nádorových tkání (barveno hematoxylinem) a stabilní buněčné linie K562 (barveno neutrální červení). Našim metodickým cílem bylo zavést kombinaci LCM s liniární amplifikací DNA pro účely dalších genetických analýz z biologického materiálu s minimálním obsahem nádorových buněk, či pro studium nádorohé heterogenity na jednobuněčné úrovni.
Buňky nasbírané pomocí LCM byly v mikropodmínkách lyzovány proteinázou K a DNA byla uvolněná do roztoku. Po tepelné inaktivaci proteinazy K, byla dvoušroubovice DNA rozštěpena restrikčním enzymem MseI a na rozštěpené konce byly navázány adaptéry se specifickými sekvencemi. Pomocí těchto sekvencí byla DNA následně amplifikována v PCR reakci. Tento primární produkt byl následně použit pro další genetické analýzy, např. komparativní genomickou hybridizaci z jediné buňky nebo amplifikaci a sekvenování exonů 19 a 21 EGFR1 receptoru pro predikci účinnosti nízkomolekulárních EGFR1 inhibitorů.
Výsledky naší pilotní studie jednoznačně demonstrují, že technika LCM je použitelná pro rutinní izolaci cílových buněk za účelem amplifikace DNA pro další (cyto)genetické analýzy.

Práce na tomto projektu je podporována granty MSM6198959216, IGA MZCR NC 7495 a MPO 1H-PK/45.