Konference: 2010 XXXIV. Brněnské onkologické dny a XXIV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Postery
Číslo abstraktu: 210p
Autoři: Hana Pavlů; Veronika Kosinová; Jitka Kuklová; RNDr. Eva Macháčková, Ph.D.; Mgr. Miroslava Miková; Mgr. Jana Házová; Doc.MUDr. Lenka Foretová , Ph.D.
Od roku 2007 používáme v naší laboratoři jako
presekvenační screeningovou metodu pro vyhledávání neznámých mutací
u hereditárního nepolypósního kolorektálního karcinomu - Lynchova
syndromu, vysokorozlišovací analýzu křivek tání (HRM) na přístroji
LightScanner firmy Idaho Technologies.
Je to vysoce senzitivní, rychlá metoda využívaná k záchytu různých mutací v krátkých fragmentech DNA v heterozygotním stavu. Je založená na principu heteroduplexní analýzy.
HRM analýza využívá vlastností fluorescenční barvy, v našem případě LCGreen, která během PCR reakce inkorporuje do dvouřetězcové DNA. Během postupného zahřívání dochází k meltingu (denaturaci) DNA a barva se z jednořetězců uvolňuje, což se projevuje poklesem fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném fragmentu DNA výrazně mění profil křivky meltingu. Tato metoda umožňuje ve většině případů přesné rozlišení různých variant a mutací lokalizovaných v analyzovaném fragmentu mnohdy i zachycení homozygotní varianty polymorfních oblastí. Rozlišení obou forem homozygotů v polymorfních oblastech však závisí na sekvenci analyzovaného úseku. Záchyt heterozygotního stavu je u metody HRM téměř 100% pro PCR fragmenty s délkou v rozmezí cca 100-500bp. Analytický program umožňuje prohlížení křivek tání a identifikaci rozdílných profilů a jejich správné vyhodnocení. Jako kontroly při vlastní analýze jednotlivých fragmentů používáme DNA se známou mutací, kontroly polymorfizmů a „slepý vzorek".
Při diagnostice HNPCC analyzujeme geny MLH1 (exon 1-19), MSH2 (exon 1-16),
MSH6 (exon 1-10). Vždy analyzujeme nejprve oblasti s výskytem mutací v české populaci, pak pokračujeme kompletní analýzou.
Pozitivní nálezy - změny v profilu křivky tání - vždy ověřujeme sekvenováním, i když se profil mutace, ve srovnání s použitým kontrolním vzorkem, jeví jako naprosto jednoznačný. Fragmenty s abnormálním meltingem jsou sekvenovány na 4 - kapilárním sekvenátoru Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems). HRM analýza slouží k detekci bodových mutací. Pro detekci intragenových přestaveb genů MLH1, MSH2, MSH6 používáme semikvantitativní metodu MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification.
Při postupech vyšetření se řídíme doporučením EMQN (The European Molecular Genetics Quality Network, www.emqn.org) a každoročně se zúčastňujeme externí kontroly kvality organizované EMQN. Tato mezinárodní kontrola kvality vyhodnocuje nejen správný záchyt mutace (genotypizace), ale také hodnotí biologickou a klinickou interpretaci nálezu.
Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva zdravotnictvíMZ0 MOU2005
Je to vysoce senzitivní, rychlá metoda využívaná k záchytu různých mutací v krátkých fragmentech DNA v heterozygotním stavu. Je založená na principu heteroduplexní analýzy.
HRM analýza využívá vlastností fluorescenční barvy, v našem případě LCGreen, která během PCR reakce inkorporuje do dvouřetězcové DNA. Během postupného zahřívání dochází k meltingu (denaturaci) DNA a barva se z jednořetězců uvolňuje, což se projevuje poklesem fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném fragmentu DNA výrazně mění profil křivky meltingu. Tato metoda umožňuje ve většině případů přesné rozlišení různých variant a mutací lokalizovaných v analyzovaném fragmentu mnohdy i zachycení homozygotní varianty polymorfních oblastí. Rozlišení obou forem homozygotů v polymorfních oblastech však závisí na sekvenci analyzovaného úseku. Záchyt heterozygotního stavu je u metody HRM téměř 100% pro PCR fragmenty s délkou v rozmezí cca 100-500bp. Analytický program umožňuje prohlížení křivek tání a identifikaci rozdílných profilů a jejich správné vyhodnocení. Jako kontroly při vlastní analýze jednotlivých fragmentů používáme DNA se známou mutací, kontroly polymorfizmů a „slepý vzorek".
Při diagnostice HNPCC analyzujeme geny MLH1 (exon 1-19), MSH2 (exon 1-16),
MSH6 (exon 1-10). Vždy analyzujeme nejprve oblasti s výskytem mutací v české populaci, pak pokračujeme kompletní analýzou.
Pozitivní nálezy - změny v profilu křivky tání - vždy ověřujeme sekvenováním, i když se profil mutace, ve srovnání s použitým kontrolním vzorkem, jeví jako naprosto jednoznačný. Fragmenty s abnormálním meltingem jsou sekvenovány na 4 - kapilárním sekvenátoru Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems). HRM analýza slouží k detekci bodových mutací. Pro detekci intragenových přestaveb genů MLH1, MSH2, MSH6 používáme semikvantitativní metodu MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification.
Při postupech vyšetření se řídíme doporučením EMQN (The European Molecular Genetics Quality Network, www.emqn.org) a každoročně se zúčastňujeme externí kontroly kvality organizované EMQN. Tato mezinárodní kontrola kvality vyhodnocuje nejen správný záchyt mutace (genotypizace), ale také hodnotí biologickou a klinickou interpretaci nálezu.
Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva zdravotnictvíMZ0 MOU2005
Datum přednesení příspěvku: 22. 4. 2010
