Využití hmotnostní spektrometrie pro studium antibiotické rezistence enterobakterií.

Stanovení antibiotické rezistence bakterií je nezbytné pro zahájení adekvátní léčby infekčních onemocnění včetně nozokomiálních nákaz. Hlavní problém představuje zvyšující se četnost multirezistentních bakteriálních kmenů a vznik nových mechanizmů rezistence. Analýza bakteriálních proteinových profilů získaných metodami hmotnostní spektrometrie umožňuje hledání nových biomarkerů antibiotické rezistence a může představovat nový přístup k identifikaci rezistentních bakterií, a tedy alternativu k současně využívaným kultivačním či molekulárně biologickým metodám. Metoda SELDI-TOF MS (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization/Time-of-Flight Mass Spectrometry je modifikací MALDI-TOF MS, která začíná být rutinně využívána v některých klinických mikrobiologických laboratořích za účelem identifikace bakteriálních druhů a kmenů. SELDI-TOF MS využívá k nanesení vzorku tzv. proteinové čipy s různými chromatografickými povrchy, které umožňují frakcionaci komplexních směsí proteinů ze vzorku, užití zlatého čipu umožňuje provést klasickou MALDI analýzu. V předchozí studii jsme již stanovili, že vliv kultivace (doba kultivace, kultivace v přítomnosti antibiotik) na proteinové spektrum je nevýznamný [1].

V této studii bylo metodou SELDI-TOF MS analyzováno celkem 56 izolátu čeledi Enterobacteriaceae od onkologických dětských pacientů z Kliniky dětské onkologie FN Brno: 37 izolátů Klebsiella pneumoniae, 7 Escherichia coli, 3 Klebsiella oxytoca, 4 Enterobacter cloacae, 3 Citrobacter freundii a 2 Proteus mirabilis. Bakterie byly kultivovány na agarových plotnách, citlivost k antibiotikům byla stanovena pomocí diskové difuzní metody. Příprava vzorků pro SELDI-TOF MS byla následující: jedna kolonie byla resuspendována ve 100 μl destilované vody a zamražena při – 70 °C, po rozmražení byla suspenze nanesena na proteinový zlatý čip a po vysušení dvakrát překryta matricí kyseliny sinapové. Měření bylo provedeno na analyzátoru SELDI- TOF MS (Ciphergen) v oblasti m/z = 3 000-20 000. Na základě klastrovací analýzy získaných proteinových spekter jsme byli schopni jednoznačně rozlišit mezi jednotlivými bakteriálními druhy. V získaných proteinových spektrech byly nalezeny také píky, které se statisticky významně lišily mezi jednotlivými kmeny a korelovaly s antibiotickým genotypem. Hmotnostně spektrometrické metody tedy mohou představovat nový přístup nejen k identifikace bakteriálních druhů a kmenů, ale také pro rychlou identifikaci antibiotické rezistence.

Literatura:

1. Dubska, L., Pilatova, K., Dolejska, M., Bortlicek, Z., Frostova, T., Literak, I., Valik, D. Surface-enhanced laser desorption ionization/time-of-flight (SELDI-TOF) mass spectrometry (MS) as a phenotypic method for rapid identification of antibiotic resistance. Anaerobe 2011; 17(6): 444-447.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem ČR pro projekt RECAMO (OP VaVpI; CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a grantem GAČR č. P502/10/P083.