Výsledky testování BRCA1 a BRCA2 genů u rizikových pacientek v molekulárně genetické laboratoři MOÚ

Úvod
5-10% případů nádorů může být způsobeno genetickou predispozicí. Pro hereditární formy nádorů je typický nízký věk v době stanovení diagnózy a bilaterální výskyt či duplicita. Dědičná dispozice k nádorům je přenášena jako autozomálně dominantní znak s vysokou penetrací. V roce 1994 a 1995 byly objeveny tumor supresorové geny BRCA1 (chromosom 17q21) a BRCA2 (chromosom 13q12-13), které jsou zodpovědné asi za 80% dědičných forem nádorů prsu nebo vaječníků. Nosička zárodečné mutace v genu BRCA1 má až 85% celoživotní riziko onemocnět nádorem prsu a až 60% riziko onemocnět nádorem vaječníků. Riziko nádorů kolorekta je asi 4x zvýšené u obou pohlaví a riziko nádorů prostaty u mužů ve vyšším věku
je až 3x vyšší. Nositelka zárodečné mutace v BRCA2 genu má stejně vysoké riziko nádorů prsu, riziko nádoru vaječníků je až 20%. Kromě toho se u obou pohlaví zvyšuje riziko nádorů kolorekta 4x, žlučníku a žlučových cest 5x, slinivky 3,5 x, žaludku
2,5x, melanomu 2,5 x a u mužů prostaty 3x i prsu – 6% celoživotní riziko. Riziko vzniku sekundárního nádoru prsu je až 60%. Vzhledem k těmto rizikům je nutné u zachycených rizikových nosičů mutace začít s cíleným screeningem nádorů již v mladém věku od 20 let.
U indikovaných případů, po genetickém poradenství a podepsání informovaného souhlasu bylo v laboratoři molekulární genetiky MOÚ testováno 311 žen z vysoce rizikových, nepříbuzných rodin, 26 pacientek s bilaterální formou nádoru prsu a/nebo ovaria a 60 pacientek se sporadickým výskytem nádoru prsu nebo ovaria do 40 let věku.
Detekovaná změna byla vždy potvrzena z druhého, nezávisle izolovaného vzorku DNA. Charakterizace mutace a její významnosti byla součástí laboratorní zprávy.
Po testování následuje vždy konzultace výsledků s případným návrhem prevence. V rodinách s identifikovanou patogenní mutací, která je jasnou příčinou dědičné predispozice, bylo vyšetřeno celkem 267 příbuzných.

Metody
U pacientek byl na úrovni genomické DNA izolované z periferní krve proveden kompletní screening kódujících oblastí a míst sestřihu (splice sites) jednotlivých exonů genů BRCA1 (22 kódujících exonů, mRNA = 5711 nt) a BRCA2 (26 kódujících exonů, mRNA = 10987 nt). Jako screeningové testy k vyhledávání blíže neurčených mutací byly použity tyto metody: „protein truncation test“ (PTT) a heteroduplex analýza (HA). Fragmenty s aberantní mobilitou detekované pomocí PTT nebo HA testu byly sekvenovány metodou přímého sekvenovaní na ALFexpress DNA automatickém sekvenátoru (Pharmacia).

Výsledky

1. 311 pacientek z vysoce rizikových nepříbuzných rodin:
   patogenní mutace byla detekována u 111 rodin (35,7 %) – 76 mutací (19 různých) v BRCA1 genu a 35 mutací (23 různých) v BRCA2 genu.
2. 26 pacientek s bilaterální formou nádoru prsu a/nebo ovaria bez rodinné anamnézy: patogenní mutace byla detekována u 9 pacientek (34,6 %).
3. 60 pacientek se sporadickým výskytem nádoru prsu nebo ovaria do 40 let věku: patogenní mutace byla detekována u 4 pacientek (6,7 %).

Nejčastěji detekovanými mutacemi byly: c.5385dupC (32 případů), c.3819_3823delGTAAA (12 případů), c.300T>G (10 případů) v BRCA1 genu a c.8138_8142delCCTTT (9 případů), c.8765_8766delAG (7 případů) v BRCA2 genu. Těchto pět mutací dohromady představuje 56,5 % všech detekovaných mutací.
Kromě častých nepatogenních polymorfismů byly u všech skupin pacientek zachyceny vzácné sekvenční varianty nejasného významu. 12 různých v BRCA1 genu a 16 různých v BRCA2 genu. V současné době nelze s jistotou určit, zda by mohla některá z těchto detekovaných variant souviset s nádorovým onemocněním pacientky nebo zda se jedná o neutrální (polymorfní) variantu bez vlivu na fenotyp.
Při testování 267 příbuzných z rodin s identifikovanou patogenní mutací byl zjištěn pozitivní výsledek (vyšetřovaný byl nosičem dané mutace) u 105 jedinců.

Závěr
V laboratoři molekulární genetiky MOÚ byl doposud proveden screening genů BRCA1 a 2 u 397 pacientek ze vzájemně nepříbuzných rodin.
Z hlediska interpretace škodlivosti mutace jsou problematickou skupinou frekvenčně vzácné sekvenční varianty nejasného významu. Před započetím spekulací o možné patogenitě detekované sekvenční varianty, je vhodné srovnat četnosti výskytu varianty ve skupině pacientů s předpokládanou genetickou predispozicí k určitému onemocnění, a její četnosti v běžné – onemocněním nezatížené – populaci. V současné době provádíme testování kontrolní skupiny (ženy starší 60 let v jejichž rodinné historii se nevyskytuje rakovina prsu ani ovaria) na přítomnost 28 různých variant neznámého významu v BRCA1 a 2 genu. Pokud se bude zkoumaná varianta vyskytovat v kontrolní skupině se stejnou četností jako u pacientů s předpokládanou genetickou predispozicí, je velmi nepravděpodobné, že by mohla mít vliv na vznik onemocnění. Odlišení patogenních mutací od polymorfních variant má velký praktický význam pro genetickém poradenství.
Rodiny s dědičným výskytem nádoru prsu/ovaria, u kterých nebyla identifikována patogenní mutace, jsou vhodnou skupinou pro vyšetření přítomnosti intragenových přeskupení BRCA1 genu metodu MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), kterou nyní v naší laboratoři zavádíme.

Práce podpořena granty: MZ 00020980501, MZd ČR-NC – 6396-3, NC-5561-3