Vliv TGF-beta1 na diferenciaci leukemických buněk HL-60 indukovanou společným působením TNF-alfa a inhibitory metabolismu kyseliny arachidonové.

Jedním z perspektivních směrů léčby onkologických onemocnění, zvláště pak leukemií, je diferenciační terapie (např. Chou et al. 2005, Jing 2004). Hlavním úskalím tohoto postupu je však selekce rezistentních klonů buněk. Strategie, jak tento problém překonat, spočívají především v kombinaci různých diferenciačních a cytotoxických drog nebo látek remodelujících DNA, proto je značné úsilí věnováno studiu signálních drah vedoucích k posílení diferenciace (Freemantle et al. 2003).
Diferenciace je vedle buněčné smrti a proliferace jedním z nejdůležitějších morfogenetických a homeostatických procesů řízených na více úrovních. Důležitou regulační úlohu zde hrají také cytokiny. Tato studie je zaměřena právě na roli transformujícího růstového faktoru β 1 (TGF-β1) a tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-α). Oba tyto cytokiny mají totiž schopnost mírně zvyšovat diferenciaci ovlivněných buněk leukemického původu a jejich účinek značně vzrůstá při společném působení s jinými diferenciačními látkami (Trinchieri et al. 1986, Okabe-Kado et al. 1991, Falk 1991, Cao et al. 2003). V předchozích studiích byl prokázán diferenciační efekt kombinace cytokinu s inhibitory metabolizmu kyseliny arachidonové (AA), zvláště s MK-886, což je inhibitor vazby proteinu FLAP na 5-lipoxygenázu, což zabrání její aktivaci (5-LPO) (Kozubik 1997 et al., Hofmanová et al. 1998, Štika et al. 2005). K potenciaci diferenciace dochází i při společném působení TNF-α a TGF-β1 (de Benedetti et al. 1990), což vedlo k hypotéze, že nejvíce diferencovaných leukemických buněk bude indukováno spolupůsobením obou cytokinů a inhibitoru 5-LPO.
Buněčným modelem této studie byla myeloidní linie HL-60 derivovaná z buněk akutní promyelocytární leukémie, která byla kultivována v RPMI 1640 médiu se sníženým obsahem séra. Buňky byly předem ovlivněny inhibitory metabolizmu AA (5 µM MK886, 10 µM proadifen – inhibitor rodiny cytochromu P450) a po jedné hodině abbyly k této suspenzi přidány cytokiny (1 ng/ml TNF- α, 100 pM TGF- β1), a to jednotlivě nebo v kombinaci. Úroveň exprese studovaných proteinů byla stanovena denzitometrickou kvantifikací Western blotů. Výskyt povrchových diferenciačních markerů CD11b, CD14, a CD36 a hladina reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) byly stanoveny pomocí průtokové cytometrie nebo pomocí luminometrie. Monocytární charakteristika buněk byla prokázána pomocí testu redukce NBT. Přítomnost buněk zaniklých apoptotickou formou buněčné smrti byla hodnocena morfologicky (barvení DAPI), průtokovou cytometrií (externalizace fosfatidylserinu – metoda Annexin V a propidium jodid) nebo pomocí detekce štěpení kaspázového substrátu PARP Western blottingem.
Nezralé leukemické buňky linie HL-60 ovlivněné společným a působením TNF- α a MK-886 (MK+TNF) dosáhly po pěti dnech inkubace vyššího stupně diferenciace v monocytární linii než ostatní kombinace. Přidání TGF-β1 k těmto dvěma látkám tedy nevedlo ke zvýšení výskytu diferencovaných buněk. Tato trojkombinace (MK+TNF+TGF) způsobila značné snížení viability a zvýšení výskytu apoptotických a nekrotických buněk. Tyto mrtvé buňky nesou znaky diferenciace, zvláště CD14, který však bývá považován i za molekulu rozeznávanou makrofágy v procesu likvidace apoptotických buněk. V dalším kroku jsme se zabývali srovnáním exprese proteinů zapojených do procesů diferenciace a apoptózy u vzorků MK+TNF a MK+TNF+TGF.

Analýza exprese enzymů podílejících se na metabolizaci AA prokázala, že u obou vzorků (MK+TNF, MK+TNF+TGF) došlo ke snížení exprese cytoplazmatické fosfolipázy A2 (cPLA2 – enzym uvolňující AA z membrán), a proto logicky nebyla zvýšena exprese obou enzymů metabolizujících AA (cyklooxygenáza 2, 5-LPO).
Metabolizace AA je spjata také s produkcí reaktivních kyslíkových radikálů (ROS), a dalších metabolitů, které hrají důležitou roli v procesu modulace aktivity transkripčních faktorů jako je NF-ĸB (Mazziere et al. 1999) nebo c-Myc (Egler et al. 2005). Pokles exprese c-Myc je totiž nutný jak k indukci diferenciace, tak apoptózy (Kumakura et al. 1996). Srovnávané vzorky (MK+TNF, MK+TNF+TGF) se však expresí těchto transkripčních faktorů nelišily – u obou došlo k zvýšení aktivity NF-ĸB (stanovená nepřímo pomocí degradace jeho inhibitoru I-ĸB) a ke snížení exprese c-Myc.
Uvedené transkripční faktory mohou také regulovat expresi anti-apoptotických proteinů rodiny Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1) (Swanson et al. 2004, Zender et al. 2005). Exprese Mcl-1 a Bcl-XL je na stejné úrovni jako kontrola v obou srovnávaných vzorcích (MK+TNF, MK+TNF+TGF), jen MK+TNF+TGF indukuje větší pokles exprese Bcl-2 než vzorek MK+TNF.
Vzhledem k tomu, že exprese proteinů spjatých s procesy diferenciace a apoptózy se významně nelišila u dvou odlišně reagujících vzorků, v další fázi jsme se zabývali mechanismem indukce diferenciace pomocí MK+TNF. Předpůsobení buněk antioxidantem N-acetyl cysteinem (NAC) zvrátilo efekt MK+TNF, kdežto přidání NAC až po ovlivnění buněk MK-886 mělo stejný efekt jako samotné MK+TNF.
Uvedené výsledky vedou k závěru, že diferenciace indukovaná spolupůsobením MK-886 a TNF-α je závislá na produkci ROS, ne však dráhou metabolizmu AA a role studovaných transkripčních faktorů a anti-apoptotických proteinů patrně není kritická pro daný proces.

Literatura

1. Cao et al. (2003), Blood, 101 (2): 498-507
2. de Benedetti et al. (1990), Blood, 75 (3): 626-32
3. Egler et al. (2005), Oncogene, 24 (54): 8038-50
4. Falk (1991), Blood, 77 (6): 1248-55
5. Freemantle et al. (2003), Oncogene, 22 (47): 7305-15
6. Hofmanová et al. (1998), Eur J Pharmacol, 350 (2-3): 273-84
7. Chou et al. (2005), Curr Opin Hematol,12 (1): 1-6
8. Jing (2004), Leuk Lymphoma, 45 (4): 639-48
9. Kozubik et al. (1997), J Leukoc Biol, 62 (2): 240-8
10. Kumakura et al. (1996), Leuk Lymphoma,23 (3-4): 383-94
11. Mazziere et al. (1999), Biochem Biophys Res Commun, 265 (1): 116-22
12. Okabe-Kado et al. (1991), Anticancer Res, 11 (1): 181-6
13. Swanson et al. (2004), J Immunol, 172 (11): 6684-91
14. Štika et al. (2005), Cancer Lett, Epub ahead of print
15. Trinchieri et al. (1986), Blood, 69 (4): 1218-24
16. Zender et al. (2005), Hepatology, 41 (2): 280-8

Tento projekt byl podporován granty č . 524/05/0595 a 524/06/P345 agentury GAČR a AVOS č . 1QS5000507