Vliv korepresorů na expresi androgenového receptoru u prostatických nádorových linií ovlivněných inhibitory histonových deacetyláz.

Úvod
Transkripční aktivita androgenového receptoru (AR) je podobně jako u jiných jaderných receptorů modulována buněčnými regulačními proteiny. Působením ligandu se androgenový receptor svou ligand-vázající doménou (ligand-binding domain, LBD) naváže na AF-1 doménu prostřednictvím FXXLF (F - Phe; X - kterákoliv aminokyselina; L - Leu) motivu lokalizovaném na N-terminálním konci AR. Touto interakcí dochází ke konformačním změnám AR a zpřístupnění jeho DNA-vázající domény (DNA-binding domain, DBD) regulačním proteinům - tzv. koregulátorům. Berrevoets et al. (2004) navrhl model, ve kterém je ligandem aktivovaný AR vázaný vždy ke dvěma typům koregulátorů. Ty mají schopnost buď zvyšovat (koaktivátory) nebo snižovat (korepresory) transkripční aktivitu androgenového receptoru. Postavení AR v tomto modelu a s tím související charakter jeho následné transkripční aktivity závisí na typu ligandu (agonista nebo antagonista) a na poměru mezi koaktivátory a korepresory v buňce. Koaktivátory nejen modulují transkripční aktivitu AR, ale jsou rovněž faktory, které mohou aktivně remodelovat chromatin a měnit jeho represivní charakter. Zjištění, že mnoho transkripčních koaktivátorů (CBP/p300, SRC-1, p160) je nositelem aktivity HAT (histone acetyltransferaze) a že transkripční korepresory tuto aktivitu také ovlivňují (HDACs - histone deacetyltransferases), dokazuje zřetelnou souvislost mezi acetylací anebo deacetylací a úrovní regulace transkripce. Korepresory mohou blokovat zvýšenou transkripční aktivitu AR, která je charakteristická pro nádory prostaty. Korepresory SMRT (silencing mediator of retinoid and thyroid) a N-CoR (nuclear receptor corepressor) existují a fungují jako velké proteinové komplexy v asociaci s HDAC3 (histone deacetylaze 3) (Li et al., 2000). Korepresory SMRT a N-CoR byly detegovány ve vazbě s AR (Hodgson et al.,2005; Liao et al., 2003), kde mohou zprostředkovávat antagonisty podmíněnou inhibici aktivity AR a potlačovat agonisty podmíněnou aktivaci některých cílových genů androgenového receptoru a to pravděpodobně z důvodu jejich asociace s HDAC3.

Materiál a metodika
Použili jsme čtyři nádorové linie odvozené z nádorů prostaty. Prostatická nádorová linie LNCaPje k androgenům sensitivní a z ní je odvozená linie C4-2, kterou lze charakterizovat jako linii k androgenům necitlivou. U obou těchto linií je exprimován funkční androgenový receptor. DU 145 a PC3 jsou prostatické nádorové linie bez exprese androgenového receptoru, tedy necitlivé k androgenům. Buňky prostatických nádorových linií byly ovlivňovány dvěma inhibitory histonových deacetyláz - butyrátem sodným (NaB) a trichostatinem A (TSA) po dobu 24 a 48 hodin. NaB byl aplikován v 1 mM a 5 mM koncentracích, TSA v 0,1 \iM a 0,5 \iM koncentracích. Expresi proteinů jsme detegovali z celkového extraktu buněk pomocí Western blot analýzy protilátkami proti AR (AR441), HDAC2 (#2545) a HDAC3 (#2632). Pro imunoprecipitační analýzy jsme použili protilátky N-CoR (H-303) a SMRTe (1542/H7). U chromatin imunoprecipitační analýzy (ChIP) byl sonikovaný lyzát imunoprecipitován s 2 \ig SMRTe (1542/H7). DNAjsme izolovali buď fenol/chloroformovou extrakcí nebo přečištěním přes kolonky (QIAquick PCR purification kit) a pro její amplifikaci byly použity primery specifické pro oblast 1. exonu AR.

Výsledky a závěr
U buněk prostatické nádorové linie LNCaP a z ní odvozené linie C4-2 jsme po jejich ovlivnění inhibitory histonových deacetyláz - NaB a TSA zjistili výrazné snížení nebo i vymizení exprese AR. Tento efekt byl výraznější po 24 hodinách a to u obou linií. U line LNCaP přetrvával i po dobu 48 hodin a byl zřetelný i u nižších koncentrací NaB (1 mM) a u TSA (0,1 \iM) . Výsledkem imunoprecipitační analýzy u prostatické nádorové linie C4-2 bylo zjištění, že na rozdíl od snížení exprese AR po aplikaci NaB, docházelo ke zvýšení exprese proteinu SMRT v porovnání s kontrolními vzorky. Tento nárůst byl patrný zejména po 48 hodinové aplikaci. U prostatické nádorové linie LNCaP jsme podobné nebo jiné rozdíly nezaznamenali.
Předpokládali jsme možné snížení exprese HDAC3 po ovlivnění buněk inhibitory histonových deacetyláz. Překvapující bylo, že rozdíl v expresi HDAC3 mezi kontrolními a ovlivněnými vzorky se objevil pouze u buněk prostatické nádorové linie DU145. Skutečnost, že používané inhibitory histonových deacetyláz nepotlačují expresi HDAC3 u ostatních používaných linií (s výjimkou linie DU145) může svědčit o vlivu SMRT nebo N-CoR, tedy dalších proteinů tohoto korepresorového komplexu.

Literatura

1. Berrevoets CA., Umar A., Trapman J., Brinkmann A.O., Differential modulation of androgen receptor transcriptional activity by the nuclear receptor co-repressor (N-CoR). Biochem J. 2004, 379:731 738.
   
2. Hodgson M.C., Astapova I., Cheng S., Lee L.J., Verhoeven M.C., Choi E., Balk S.P., Hollenberg A.N., The androgen receptor recruits nuclear receptor corepressor (N-CoR) in the presence of mifepristone via its N and C termini revealing a novel molecular mechanism for androgen receptor antagonists. The Journal ofBiological Chemistry 2005, 280: 6511 6519.
   
3. Li J., Wang J., Wang Jianxiang, Nawaz Z., Liu J.M., Qin J., Wong J., Both corepressor proteins SMRT and N-CoR exist in large protein complexes containing HDAC3. The EMBO Journal 2000, 19: 4342 4350.
   
4. Liao G., Chen L.-Y., Zhang A., Godavarthy A., Xia F., Ghosh J.Ch., Li H., Chen J.D. Regulation of androgen receptor activity by the nuclear receptor corepressor SMRT. The Journal ofBiological Chemistry 2003, 278: 5052 5061.

Práce byla financována grantem IGA NR9475-3/2007 a podpořena z MSM 6198959216.