Vliv butyrátu sodného na expresi dvou koregulátorů androgenového receptoru a na viabilitu vybraných prostatických nádorových linií.

Úvod

Androgenový receptor (AR) je ligandem indukovaný transkripční faktor, patřící do rozsáhlé rodiny steroidních jaderných hormonálních receptorů. Androgenový receptor tvoří funkční transkripční komplexy s mnoha různými koregulátorovými proteiny. Koregulátory (transkripční kofaktory) se dělí na koaktivátory, které zvyšují transkripční aktivitu jaderných receptorů a na korepresory, které transkripční aktivitu jaderných receptorů naopak snižují. Oba typy koregulátorů hrají důležitou roli v AR-zprostředkovaném růstu a progresi prostatických nádorových buněk.

Mezi známé koregulátory AR patří korepresor SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors) a koaktivátor p300. Je známo, že mezi korepresory a koaktivátory existuje kompetice o vazbu na AR v přítomnosti jeho ligandů (androgenů). Korepresor SMRT se v přítomnosti ligandu může vázat také do oblasti N–terminální transaktivační domény AR, kam se vážou i mnohé koaktivátory AR. K vazbě korepresoru SMRT na AR s navázaným ligandem dochází jen v případě, kdy je korepresor SMRT nadměrně exprimován (ve srovnání s úrovní exprese koaktivátorů). Interakce AR s komplexy obsahujícími SMRT vede následně k zablokování možné vazby koaktivátorů na AR a tedy i k inhibici transaktivační funkce AR.

Butyrát sodný (NaB), patřící mezi inhibitory histonových deacetyláz (HDACI), je přirozeně se vyskytující netoxická látka. Tato látka může pozměnit acetylace histonů a tím ovlivnit expresi velkého množství genů. Může tedy ovlivnit i expresi koregulátorů. In vitro NaB inhibuje růst a podporuje apoptózu buněk různých lidských prostatických nádorových buněčných linií.

Materiál a metody

Byly použity celkem tři prostatické buněčné linie. Dvě z nich byly nádorové (LNCaP, C4-2) a jedna nenádorová (RWPE-1), která sloužila jako kontrolní linie. Prostatická nádorová linie LNCaP je androgen senzitivní, kdežto z ní odvozená linie C4-2 je androgen nesenzitivní. Obě tyto prostatické nádorové linie exprimují funkční androgenový receptor.

Buňky prostatických nádorových linií a buňky prostatické nenádorové linie byly ovlivňovány inhibitorem histonových deacetyláz butyrátem sodným (NaB) o koncentracích 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM a/nebo 5 mM a inkubovány po dobu 24 nebo 48 hodin. Pro posouzení vlivu butyrátu sodného na expresi dvou koregulátorů AR (koaktivátoru p300 a korepresoru SMRT) byla provedena kvantitativní analýza real-time PCR. Pro zjištění cytotoxicity NaB a pro stanovení jeho vlivu na viabilitu buněk byl proveden MTT test. Roztoky NaB byly připraveny rozpuštěním NaB v 10% roztoku dimethylsulfoxidu (DMSO). Buňky sloužící v experimentech jako kontrola byly ovlivněny 0,1% roztokem DMSO.

Pro posouzení změn v expresi koaktivátoru p300 a korepresoru SMRT byly buňky tří výše uvedených prostatických linií nejprve kultivovány v médiu na Petriho miskách při 37 °C a v 5% atmosféře CO₂. Po dosažení přibližně 75% konfluence byly ovlivněny 0,1% DMSO, 1mM a/nebo 5mM NaB. Následovala inkubace buněk po dobu 24 nebo 48 hodin. Z buněk byla poté izolována celková RNA pomocí High Pure RNA Isolation Kitu (Roche) a reverzní transkripcí pomocí Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kitu (Roche) byla získána cDNA. Tato cDNA byla použita pro kvantitativní real-time PCR za použití specifických TaqMan sond. Výsledná změna v expresi p300 a SMRT byla vypočítána metodou ∆∆Ct.

Buňky pro MTT test byly nasazeny do 96-jamkových mikrotitračních destiček a kultivovány v médiu při 37 °C a v 5% atmosféře CO₂. Po adhezi buněk na dno bylo v jamkách vyměněno médium za čerstvé s obsahem účinné látky (NaB) o koncentracích 0,5mM, 1mM, 2,5mM a/nebo 5mM nebo s obsahem 0,1% DMSO u kontroly. Poté byly buňky inkubovány po dobu 24 nebo 48 hodin. Po uplynutí příslušné doby inkubace byl do každé jamky přidán 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromid (MTT). Výsledná absorbance změřená na spektrofotometru při vlnové délce 570 nm přímo koreluje s počtem vitálních buněk.

Výsledky

Kvantitativní real-time PCR analýza ukázala, že NaB má vliv na expresi koaktivátoru p300 i korepresoru SMRT a to zejména u prostatických nádorových linií LNCaP a C4-2. U nenádorové linie RWPE-1 NaB ovlivňoval expresi p300 a SMRT podstatně méně. Vliv NaB na expresi těchto dvou koregulátorů AR se liší nejen v závislosti na jeho použité koncentraci, ale také v závislosti na délce působení této účinné látky. Změny v expresi p300 a SMRT u jednotlivých buněčných linií jsou uvedeny v následující tabulce.



MTT test ukázal, že NaB ovlivňuje viabilitu buněk obou prostatických nádorových linií i viabilitu buněk nenádorové linie. U linie LNCaP došlo po 24-hodinové inkubaci s NaB (ve srovnání s kontrolou) k poklesu viability o 10% při použití 2,5mM NaB a tento trend pokračoval snížením viability o 30 % při použití 5mM NaB. Po 48-hodinové inkubaci s NaB poklesla viabilita o 20% při použití 0,5mM a 2,5mM NaB, k dalšímu poklesu, a to až o 50% došlo při použití 5mM NaB. Vyjímkou bylo mírné zvýšení viability při použití 1mM NaB. U linie C4-2 byl po 24-hodinové inkubaci viditelný pozvolný pokles viability v závislosti na zvyšujících se koncentracích NaB, kdy při použití 5mM NaB došlo k poklesu viability o 20%. Po 48-hodinové inkubaci této linie s NaB byl pokles viability se zvyšujícími se koncentracemi NaB rapidnější. Už při použití 0,5mM NaB došlo k poklesu viability o téměř 30% a po ošetření buněk 5mM NaB klesla viabilita až o 60%.

U nenádorové linie buněk RWPE-1 byl vliv NaB na viabilitu nejmenší ze všech tří testovaných linií. Po 24-hodinové inkubaci s NaB došlo k náhlému snížení viability buněk (asi o 30%) až při použití 2,5mM koncentrace NaB, ale při použití nejvyšší (5mM) koncentrace NaB činilo snížení viability jen asi 20%. U této linie byl po 48-hodinové inkubaci viditelný pozvolný pokles viability v závislosti na zvyšujících se koncentracích NaB, kdy při použití 5mM NaB došlo k poklesu viability o 30%.

Závěr

Kvantitativní real-time PCR analýza potvrdila, že NaB u nádorových buněčných linií má vliv na zvýšení exprese sledovaných koregulátorů, zejména korepresoru SMRT. U nenádorové buněčné linie je vliv NaB na expresi koregulátorů nízký. Pomocí MTT testů bylo prokázáno, že vliv NaB na viabilitu buněk je vyšší u nádorových buněčných linií a to zejména po 48-hodinové kultivaci s NaB.

Reference:

1. Rahman, M., Miyamoto, H. et Chang, Ch. (2004): Androgen receptor coregulators in prostate cancer: Mechanisms and clinical implications. Clinical Cancer Research (10), 2208–2219.
   
2. Heemers, H.V., Regan, K.M., Schmidt, L.J., Anderson, S.K., Ballman, K.V. et Tindall, D.J. (2009): Androgen modulation of coregulator expression in prostate cancer cells. Molecular Endocrinology (23), 572–583.
   
3. Liao, G., Chen, L.–Y, Zhang, A., Godavarthy, A., Xia, F., Ghosh, J.–Ch., Li, H. et Chen, J.D. (2003): Regulation of androgen receptor activity by the nuclear receptor corepressor SMRT. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology (278), 5052–5061.
   
4. Gu, J., Zhao, X., Spanjaard, R. A., Chen, T. C., Flanagan, J. N., Boosalis, M., Perrine, S.P. et Faller, D.V. (2006): Histone deacetylase–inhibitors sensitize human prostate cancer cell lines to growth suppression and apoptosis by retinoids. Journal of Cancer Molecules (2), 25–36.
   
5. Dotzlaw, H., Moehren, U., Mink, S., Cato, A. C. B., Iñiguez Lluhí, J. A. et Baniahmad, A. (2002): The amino terminus of the human AR is target for corepressor action and antihormone agonism. Molecular Endocrinology (16), 661–673.
   
6. Yuan, H., Liddle, F.J., Mahajan, S. et Frank, D. A. (2004): IL–6–induced survival of colorectal carcinoma cells is inhibited by butyrate through down–regulation of the IL–6 receptor. Carcinogenesis (25), 2247–2255.

Práce byla financována grantem IGA NS10262-3/2009, GAČR 303/09/H048 a podpořena z MSM 6198959216.