Valproát má antiangiogenní účinek a potencuje cisplatinu a ellipticin v neuroblastomových buněčných liniích

Úvod: Neuroblastom patří mezi nejčastější malignity dětského věku. Prognóza nemocných s biologicky nepříznivými formami neuroblastomu je i přes intenzivní léčbu často infaustní. Terapeutický zásah, který by zvyšoval účinnost cytostatik, by byl pro nemocné postižené touto malignitou značným přínosem. V naší práci jsme se zaměřili na vliv kyseliny valproové (VPA) na neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 a UKF-NB-3 rezistentní na cisplatinu. VPA je běžně používané antiepileptikum, které se v poslední době ukazuje i jako efektivní protinádorové agens. Mechanizmus jeho působení se vysvětluje především epigeneticky inhibičním působením na histondeacetylázy (HDAC). Úplné vysvětlení jeho protinádorového působení tato teorie však nepodává. V naší práci jsme proto hodnotili i vliv VPA na angiogenezi, který může přispívat k jeho protinádorovým účinkům. Hypoxie v nádorech koreluje s rozsahem onemocnění a jeho horším průběhem. Klinicky významná je zvláště hypoxií indukovaná rezistence k radioterapii a chemoterapii, genomová instabilita a indukce angiogenezy.

Cíle:

1. Stanovit, zda VPA potencuje účinek cisplatiny a elepticinu v normoxii a v hypoxii
2. potvrdit, že hyperacetylace histonů hraje roli v protinádorovém účinku VPA
3. posoudit vliv VPA na angiogenezi.

Materiál a metody: Experimenty byly prováděny na buněčných liniích odvozených od neuroblastomu vysokého stupně rizika UKF-NB-4 a UKF-NB-3 a od nich odvozených linií rezistentních na cisplatinu. Efekt 24 hodinové preinkubace 1 mM VPA jsme určovali pomocí MTT testu. Tato koncentrace VPA je dosahována v séru pacientů při antiepileptické léčbě. Antiangiogenní potenciál VPA byl studován pomocí capillary-like tube formation testu na endoteliích z lidské pupečníkové vény (HUVEC). Přítomnost hyperacetylovaných histonů H3 a H4 byla určena Western blotem. V některých experimentech byl použit jiný, specifičtější, inhibitor HDAC trichostatin A v koncentraci 100 nM. Na indukci hypoxických podmínek jsme buněčné kultury kultivovali v uzavřeném systému (Hypoxic chamber, Billups-Rothenberg, Inc., USA) s definovanou směsí plynů O₂ (1%), CO₂ (5%), N₂ (94%). Hypoxický fenotyp testovaných buněk jsme ověřovali kontrolou exprese proteinu HIF-1αlfa pomocí Western blotu s králičí polyklonální protilátkou (Upstate Biochemicals).

Výsledky: Preinkubace obou buněčných linií 1 mM VPA snížila IC50 elipticinu i cisplatiny v normoxických i hypoxických podmínkách. VPA i trichostatin A signifikantně snížil počet „křížení“ v capillary-like tube formation testu. Hyperacetylace histonů byla potvrzena jak v hypoxii, tak v normoxii. Proti očekávání jsme opakovaně pozorovali, že VPA způsobuje vyšší hyperacetylaci histonů než TSA.

Závěr: Můžeme konstatovat, že VPA potencuje účinek ellipticinu i cisplatiny. Důležitým bodem našeho pozorování je synergický efekt VPA a ellipticinu nejen v normoxii, ale i v hypoxii. Potvrdili jsme, že preinkubace VPA způsobuje hyperacetylaci histonů H3 i H4. K protinádorovému účinku VPA mohou příspívat i jeho antiangiogenní vlastnosti. Naše výsledky i literární údaje ukazují, že možnost potenciace účinků cytostatik VPA může přispět ke zlepšení léčebných výsledků některých nádorů včetně neuroblastomu vysokého rizika.

Podpořeno grantem GAUK 72208/2008.