Konference: 2011 XXXV. Brněnské onkologické dny a XXV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Pokroky v biologii nádorů
Číslo abstraktu: 149
Autoři: MUDr. Šimon Cipro; MVDr. Jan Hraběta; MUDr. Jana Hřebačková; RNDr. Jitka Poljaková; prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.
Úvod
Kyselina valproová (VPA), jedno z nejdéle užívaných antiepileptik, kromě antiepileptických účinků inhibuje aktivitu histondeacetyláz (HDAC). Inhibitory HDAC (HDACi) se v posledních letech ukazují jako nadějná protinádorová léčiva. Tyto látky mají komplexní účinek na nádorové buňky: ovlivňují buněčný cyklus, indukují apoptozu ale i autofagii a senescenci a byl prokázán i antiangiogenní účinek VPA [1]. Zdá se, že HDACi významně potencují účinek řady cytostatik. Jedním z mechanismů této potenciace je snazší přístup interkalačních látek k DNA zvýšením acetylace histonů [1]. V současnosti probíhají klinické studie se SAHA (Vorinostat), VPA, butyrátem, depsipeptidem, PXD101a MS-275 [1,2]. Testovány jsou i kombinace s cytostatiky a/nebo radioterapií. Racionálním podkladem pro klinické zkoušení VPA v protinádorové terapii je kromě příznivých výsledků experimentů in vitro a in vivo i její nízká toxicita i při dlouhodobém podávání a dlouhodbé zkušenosti s jejím podáváním.
Prakticky ve všech solidních nádorech jsou v důsledku rychlého růstu a neadekvátní angiogeneze přítomny oblasti s nižší tenzí kyslíku (1% O2 a méně, dále označováno jako hypoxie). Změny exprese genů indukovaných hypoxií, které se podílejí na jejich vzniku a progresi byly prokázány u řady nádorů. Hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF) je hlavní transkripční faktor aktivovaný hypoxií. Je tvořen dvěmi podjednotkami ARNT/HIF-1α a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. HIF-2α se podílí na dediferenciaci a agresivnějším fenotypu buněk neuroblastomu. Hypoxie je jednou z příčin snížení cytostatiky indukované apoptózy a zvýšení klonogenní rezistence a genetické nestability [3,4]. Z našich experimentů vyplývá, že hypoxie u buněčných linií neuroblastomů a glioblastomu významně inhibuje apoptózu a přispívá tak k jejich rezistenci [5]. Domníváme se, že antiapoptotické působení hypoxií indukovaných transkripčních faktorů je závislé na typu nádoru a použitém protinádorovém léčivu. U některých nádorů byla exprese HIF známkou horší prognózy [6].
Cíle
V naší práci jsme se zaměřili na studium účinku VPA na neuroblastomové (NBL) buněčné linie v normoxických a hypoxických podmínkách.
Metody
Experimenty jsme provedli na NBL liniích UKF-NB-3, UKF-NB-4, IMR-32 a SK-N-AS odvozených od nádorů vysokého rizika. Apoptózu jsme stanovili průtokovým cytometrem barvením propidium iodidem a fluorescenčně značeným anexinnem V. Aktivitu kaspáz jsme měřili kolorimetricky za použití specifických substrátů. Expresi na úrovni proteinů jsme vyšetřovali Western blotingem a na úrovni m-RNA RT PCR v reálném časeza použití TaqMan sond. Zastoupení fází buněčného cyklu jsme hodnotili cytometricky po obarvení propidium jodidem.
Buňky byly inkubovány s různými koncentracemi VPA v rozsahu 0,5 mM – 10 mM (sérové hladiny u epileptiků léčených VPA se pohybují kolem 0,8 mM) po dobu 24, 48 a 72 hodin paralelně v normoxii a hypoxii a srovnávali jsme efekt s účinkem cisplatiny, která je v hypoxii významně méně účinná než v normoxii.
Výsledky a diskuze
Množství valproátem indukované apoptózy bylo v hypoxii u všech zkoumaných linií vyšší nebo přinejmenším stejné jako v normoxii. Např. linie UKF-NB-3 13,7% v hypoxii a 8,2% v normoxii po 72h inkubaci s 1mM VPA. Tato pozorování jsme podpořili měřením aktivity kaspázy-3 (hlavní efektorová kaspáza) po inkubaci s VPA nebo cisplatinou. VPA na rozdíl od cisplatiny indukuje vyšší aktivitu kaspázy-3 v hypoxii než normoxii (325% oproti 250% kontroly). Tyto výsledky ukazují, že hypoxie nezpůsobuje primární rezistenci NBL buněk k VPA. Pro klinickou praxi by mohlo být významné zjištění, že kombinace VPA a cisplatiny měla na NBL buňky aditivní účinek a tato kombinovaná léčba byla účinnější v hypoxii než v normoxii. VPA tedy zvrátil hypoxií indukovanou rezistenci vůči cisplatině a její účinek potencoval.
K ověření, zda vyšší účinnost v podmínkách nižší tenze kyslíku je společnou vlastností všech inhibitorů histon deacetyláz, jsme stanovili apoptózu pomocí anexinnu V a aktivity kaspázy 3 s butyrátem sodným (NaB) a trichostatinem A. Rovněž jsme porovnali účinek VPA s choloridem lithným, který má na buňky shodné účinky jako VPA s výjimkou inhibice HDAC. Výsledky těchto pokusů ukazují, že všechny inhibitory histon deacetyláz jsou účinnější v hypoxických podmínkách. Největší rozdíl mezi účinkem v hypoxii a v normoxii byl u VPA a NaB. Obě tyto látky patří do stejné chemické skupiny (mastné kyseliny s krátkým řetězcem). Trichostatin byl prakticky stejně účinný v hypoxii I v normoxii. Indukce apoptozy v NBL buňkách chloridem lithným v hypoxii I normoxii byla identická přičemž tato látka není příliš účinný induktor apoptozy u NBL.
Western blotem jsme neprokázali štěpení proteinu Bid, což naznačuje, že VPA neindukuje mitochondriální apoptotickou dráhu. Zároveň jsme stanovili množství neaktivního Bid. Jeho vysoké hladiny po inkubaci s VPA podporují hypotézu, že nedochází k přesmyku z receptorové do vnitřní apoptotické dráhy.
Řada neuroblastomů má in vivo i in vitro defektní vnější apoptotickou dráhu díky deleci nebo častěji epigenetické modifikaci genu pro kaspázu 8. Metodou qRT PCR jsme prokázali, že VPA obnovuje expresi této kaspázy v normoxii i hypoxii, čímž umožňuje použití látek indukujících apoptózu vnější cestou.
Souhrn
Naše výsledky rozšiřují znalosti o mechanismech účinku VPA na nádorové buňky a naznačují možnost jejího užití i v oblastech, kde konvenční léčba často selhává. Naše výsledky i literární údaje podporují možnost použití VPA pro klinické zkoušení.
Literatura:
Tato práce vznikla za finanční podpory GAUK (č.projektu 72208/2008) a GAČR (č.projektu P301/10/0356).
Kyselina valproová (VPA), jedno z nejdéle užívaných antiepileptik, kromě antiepileptických účinků inhibuje aktivitu histondeacetyláz (HDAC). Inhibitory HDAC (HDACi) se v posledních letech ukazují jako nadějná protinádorová léčiva. Tyto látky mají komplexní účinek na nádorové buňky: ovlivňují buněčný cyklus, indukují apoptozu ale i autofagii a senescenci a byl prokázán i antiangiogenní účinek VPA [1]. Zdá se, že HDACi významně potencují účinek řady cytostatik. Jedním z mechanismů této potenciace je snazší přístup interkalačních látek k DNA zvýšením acetylace histonů [1]. V současnosti probíhají klinické studie se SAHA (Vorinostat), VPA, butyrátem, depsipeptidem, PXD101a MS-275 [1,2]. Testovány jsou i kombinace s cytostatiky a/nebo radioterapií. Racionálním podkladem pro klinické zkoušení VPA v protinádorové terapii je kromě příznivých výsledků experimentů in vitro a in vivo i její nízká toxicita i při dlouhodobém podávání a dlouhodbé zkušenosti s jejím podáváním.
Prakticky ve všech solidních nádorech jsou v důsledku rychlého růstu a neadekvátní angiogeneze přítomny oblasti s nižší tenzí kyslíku (1% O2 a méně, dále označováno jako hypoxie). Změny exprese genů indukovaných hypoxií, které se podílejí na jejich vzniku a progresi byly prokázány u řady nádorů. Hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF) je hlavní transkripční faktor aktivovaný hypoxií. Je tvořen dvěmi podjednotkami ARNT/HIF-1α a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. HIF-2α se podílí na dediferenciaci a agresivnějším fenotypu buněk neuroblastomu. Hypoxie je jednou z příčin snížení cytostatiky indukované apoptózy a zvýšení klonogenní rezistence a genetické nestability [3,4]. Z našich experimentů vyplývá, že hypoxie u buněčných linií neuroblastomů a glioblastomu významně inhibuje apoptózu a přispívá tak k jejich rezistenci [5]. Domníváme se, že antiapoptotické působení hypoxií indukovaných transkripčních faktorů je závislé na typu nádoru a použitém protinádorovém léčivu. U některých nádorů byla exprese HIF známkou horší prognózy [6].
Cíle
V naší práci jsme se zaměřili na studium účinku VPA na neuroblastomové (NBL) buněčné linie v normoxických a hypoxických podmínkách.
Metody
Experimenty jsme provedli na NBL liniích UKF-NB-3, UKF-NB-4, IMR-32 a SK-N-AS odvozených od nádorů vysokého rizika. Apoptózu jsme stanovili průtokovým cytometrem barvením propidium iodidem a fluorescenčně značeným anexinnem V. Aktivitu kaspáz jsme měřili kolorimetricky za použití specifických substrátů. Expresi na úrovni proteinů jsme vyšetřovali Western blotingem a na úrovni m-RNA RT PCR v reálném časeza použití TaqMan sond. Zastoupení fází buněčného cyklu jsme hodnotili cytometricky po obarvení propidium jodidem.
Buňky byly inkubovány s různými koncentracemi VPA v rozsahu 0,5 mM – 10 mM (sérové hladiny u epileptiků léčených VPA se pohybují kolem 0,8 mM) po dobu 24, 48 a 72 hodin paralelně v normoxii a hypoxii a srovnávali jsme efekt s účinkem cisplatiny, která je v hypoxii významně méně účinná než v normoxii.
Výsledky a diskuze
Množství valproátem indukované apoptózy bylo v hypoxii u všech zkoumaných linií vyšší nebo přinejmenším stejné jako v normoxii. Např. linie UKF-NB-3 13,7% v hypoxii a 8,2% v normoxii po 72h inkubaci s 1mM VPA. Tato pozorování jsme podpořili měřením aktivity kaspázy-3 (hlavní efektorová kaspáza) po inkubaci s VPA nebo cisplatinou. VPA na rozdíl od cisplatiny indukuje vyšší aktivitu kaspázy-3 v hypoxii než normoxii (325% oproti 250% kontroly). Tyto výsledky ukazují, že hypoxie nezpůsobuje primární rezistenci NBL buněk k VPA. Pro klinickou praxi by mohlo být významné zjištění, že kombinace VPA a cisplatiny měla na NBL buňky aditivní účinek a tato kombinovaná léčba byla účinnější v hypoxii než v normoxii. VPA tedy zvrátil hypoxií indukovanou rezistenci vůči cisplatině a její účinek potencoval.
K ověření, zda vyšší účinnost v podmínkách nižší tenze kyslíku je společnou vlastností všech inhibitorů histon deacetyláz, jsme stanovili apoptózu pomocí anexinnu V a aktivity kaspázy 3 s butyrátem sodným (NaB) a trichostatinem A. Rovněž jsme porovnali účinek VPA s choloridem lithným, který má na buňky shodné účinky jako VPA s výjimkou inhibice HDAC. Výsledky těchto pokusů ukazují, že všechny inhibitory histon deacetyláz jsou účinnější v hypoxických podmínkách. Největší rozdíl mezi účinkem v hypoxii a v normoxii byl u VPA a NaB. Obě tyto látky patří do stejné chemické skupiny (mastné kyseliny s krátkým řetězcem). Trichostatin byl prakticky stejně účinný v hypoxii I v normoxii. Indukce apoptozy v NBL buňkách chloridem lithným v hypoxii I normoxii byla identická přičemž tato látka není příliš účinný induktor apoptozy u NBL.
Western blotem jsme neprokázali štěpení proteinu Bid, což naznačuje, že VPA neindukuje mitochondriální apoptotickou dráhu. Zároveň jsme stanovili množství neaktivního Bid. Jeho vysoké hladiny po inkubaci s VPA podporují hypotézu, že nedochází k přesmyku z receptorové do vnitřní apoptotické dráhy.
Řada neuroblastomů má in vivo i in vitro defektní vnější apoptotickou dráhu díky deleci nebo častěji epigenetické modifikaci genu pro kaspázu 8. Metodou qRT PCR jsme prokázali, že VPA obnovuje expresi této kaspázy v normoxii i hypoxii, čímž umožňuje použití látek indukujících apoptózu vnější cestou.
Souhrn
Naše výsledky rozšiřují znalosti o mechanismech účinku VPA na nádorové buňky a naznačují možnost jejího užití i v oblastech, kde konvenční léčba často selhává. Naše výsledky i literární údaje podporují možnost použití VPA pro klinické zkoušení.
Literatura:
- Hrebackova J, Hrabeta J, Eckschlager T. Valproic acid in the
complex therapy of malignant tumors. Curr Drug Targets.
2010;11:361-79.
- Biancotto C, Frigè G, Minucci S. Histone modification therapy
of cancer. Adv Genet. 2010;70:341-86.
- Poljaková J, Eckschlager T, Hřebačková J, Hraběta J, Stiborová
M. The comparison of cytotoxicity of the anticancer drugs
doxorubicin and ellipticine to human neuroblastoma cells.
Interdiscip Toxicol. 2008;1:186-9.
- Moeller BJ, Dewhirst MW. HIF-1 and tumour radiosensitivity. Br
J Cancer. 2006;95:1-5
- Hraběta J., Cipro Š., Poljaková J., Hřebáčková J., Stiborová
M., Eckschlager T. Hypoxií indukovaná chemorezistence buněk
neuroblastomu a mozkových nádorů – studie in vitro. Souhrny XXXIV.
Brněnské onkologické dny 2010
- DeClerck K, Elble RC. The role of hypoxia and acidosis in promoting metastasis and resistance to chemotherapy. Front Biosci. 2010;15:213-25.
Tato práce vznikla za finanční podpory GAUK (č.projektu 72208/2008) a GAČR (č.projektu P301/10/0356).
Datum přednesení příspěvku: 22. 4. 2011
