Konference: 2007 12. ročník odborného sympózia Onkologie v gynekologii a mammologii
Kategorie: Onkologická rizika a prevence
Téma: II. Rizikové faktory
Číslo abstraktu: 011
Autoři: MUDr. Helena Hornychová, Ph.D.; prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.; prof. MUDr. Bohuslav Melichar, Ph.D.; MUDr. Markéta Tomšová, Ph.D.; MUDr. Eva Hovorková; M. Posltová; MUDr. Petra Kašparová, Ph.D.; P. Hornych
Práce byla podpořena grantem MZ ČR IGA NR 8392-3/2005.
Úvod:
Zvýšená schopnost novotvorby kapilár (angioneogeneze) je u nádorových onemocnění obecně uznávaným prognostickým faktorem spojovaným s horší prognózou onemocnění. Tumory s vyšší vaskularizací mohou růst rychleji v důsledku lepšího zásobení.
Vzhledem k nedokonalosti stavby novotvořené kapilární stěny (zejména její bazální membrány) mají snadnější možnost metastazování.
K hodnocení schopnosti angiogeneze se používá jednak metodika imunohistochemické detekce a kvantifikace kapilár ve vzorku z nádorové tkáně, dále pak průkaz angiogenních působků produkovaných tumorem buď imunohistochemicky ve vzorcích nádorové tkáně, nebo sledováním jejich hladin v krvi.
V našem souboru jsme se pokusili zhodnotit možnost vyšetřování angiogeneze v materiálu z biopsie tumoru před podáním neoadjuvantní chemoterapie. Šlo o pokus o upravení metodiky kvantifikace kapilár tak, aby byla vhodná k vyšetření malých vzorků tumoru z jehlové biopsie prsu, s cílem zjistit, zda takto hodnocená angiogeneze je prediktivním faktorem odpovědi na neoadjuvantní chemoterapii. Pro zobrazení kapilár byly použity panendoteliální markery CD 31 a CD 34 a dále marker považovaný za specifický pro aktivované endotelie – CD 105 (endoglin) – součást receptoru pro angiogenní faktor TGFβ. Dále byla hodnocena exprese VEGF (vascular endothelial growth factor) produkovaného nádorovými buňkami nebo buňkami nádorového stromatu. Výsledky byly srovnávány s expresí standardně vyšetřovaných imunohistochemických markerů: estrogenových a progesteronových receptorů, proliferačního markeru Ki-67, onkoproteinu p53 a onkoproteinu HER2/neu.
Vzhledem ke korelaci patologické kompletní odpovědi s dlouhodobou prognózou přežití nemocných s karcinomem prsu po neoadjuvantní chemoterapii lze užít odpovědi na neoadjuvantní chemoterapii jako náhradního prognostického ukazatele.
Metodika:
U každé ze 73 pacientek (vybraných ze základního souboru pacientek sledovaných na Klinice onkologie a radioterapie FN Hradec Králové, léčených neoadjuvantní chemoterapií – kombinací paclitaxelu a doxorubicinu –v letech 1998-2003 na základě dostatečného množství materiálu získaného punkční biopsií nádoru) byl vyšetřován materiál z jehlové biopsie prsu nebo drobné kožní excize (u tumorů infiltrujících kůži) odebraný před podáním neoadjuvantní chemoterapie a následně resekát prsu. Materiál byl standardně zpracován, fixován formalínem a zalit v parafinu. Řezy silné 4 μm byly barveny hematoxylinem eosinem. Imunohistochemická barvení byla prováděna streptavidin-biotinovou metodou s peroxidázovým detekčním systémem (EnVision, DAKO). Použité markery: CD 31 (monoklonální, JC70A, DAKO), CD 34 (monoklonální, QBEnd 10, 1:50, DAKO), CD 105 (monoklonální, SN6h, DAKO) a VEGF (polyklonální, NeoMarkers), estrogenové receptory (1D5, DAKO), progesteronové receptory (PgR636, DAKO), Ki-67 (MIB-1, DAKO), p53 TM(DO-7, DAKO). K průkazu exprese HER2/neu byl použit kit HercepTestTM (DAKO)
Byl kvantifikován počet kapilár v nádorové tkáni. Při malém zvětšení (40x) byla vybírána místa s největším počtem kapilár, ve kterých pak při zvětšení 400x (při průměru zorného pole 0,5 mm) byly spočítány luminizované kapiláry do průměru 10 μm. Vybírána byla – vzhledem k různé velikosti hodnocených vzorků (s různým počtem ložisek s největším počtem kapilár) pouze jedna maximální hodnota. Exprese VEGF byla hodnocena v nádorových buňkách semikvantitativně (0, +, ++ a +++). Ostatní rutinně vyšetřované markery byly hodnoceny standardně (u ER a PR IRS skóre, procento Ki-67 pozitivních nádorových buněk, semikvantitativní hodnocení p53 včetně procenta pozitivních nádorových buněk a HER skóre).
Statistické hodnocení bylo provedeno Mann-Whitneyovým testem.
Výsledky:
Věk pacientek v souboru se pohyboval od 22 do 75 let, medián věku 56 let. Patologická kompletní remise (ve smyslu Chevallierovy klasifikace stupeň 1 a 2) – tedy nepřítomnost invazivního tumoru v resekátu – se vyskytla u 15 pacientek (20 %). V dalším textu čísla psaná kurzívou odpovídají počtům a procentuálním poměrům ve skupině bez přítomnosti invazivního tumoru v resekátu.
Z celkového počtu 73 tumorů bylo:53 tumorů (73 %) duktálních toho 10 ve skupině s pCR), 13 (18 %) lobulárních (z toho 1 ve skupině s pCR), 7 ostatních typů (z toho 4 ve skupině s pCR); stupeň diferenciace byl ve 3 tumorech (4 %) (1 resp. 7 %) grade 1, v 36 (49 %) (6 resp. 40 %) grade 2 a v 34 (45 %) (8 resp. 53 %) grade 3.
Medián počtu kapilár na zorné pole největšího zvětšení byl u značení endotelií pomocí CD 31 4 kapiláry (od 1 do 13)(5 kapilár od 2 do 10), pomocí CD 105 3 kapiláry (od 0 do 11) (4 kapiláry, od 0 do 8), pomocí CD 34 6 kapilár (od 2 do 17) (8 kapilár, od 3 do 11).
Exprese VEGF byla vysoká u 30 tumorů (41 %)(7, resp.47 %) , střední u 24 (33 %) (5, resp. 33 %), nízká u 12 (16 %) (1, resp.7 %) , nebyla prokázána u 7 (10 %) (2, resp.13 %)
Medián IRS skóre pro estrogenové receptory byl 6 (od 0 do 12) (2, od 0 do 12), pro progesteronové receptory 2 (od 0 do 12)(0, od 0 do 9).
Medián procenta pozitivity Ki-67 byl 20 (od 3 do 90) (25, od 10 do 80).
Exprese p53 byla vysoká u 5 tumorů (7 %) (3, resp. 20 % ), střední u 14 (19 %) (5, resp. 33 %), nízká u 9 (12 %) (2, resp.14 % ), nebyla prokázána u 45 (62 %) (5, resp.33 %).
HER skóre 0 bylo u 29 tumorů (40 %) (5, resp. 33 %), 1 u 25 (34 %) (3, resp 20 %), 2 u 9 (12 %) (2, resp. 14 %) a 3 u 10 (14 %) (5, resp. 33 %).
Statisticky významný rozdíl mezi skupinou s patologickou kompletní odpovědí a ostatními pacientkami byl nalezen u kvantifikace kapilár pomocí CD 31 (p=0,0237), u hodnocení exprese progesteronových receptorů pomocí IRS skóre (p=0,0035) a u semikvantitativního i procentuálního hodnocení exprese p53 (p=0,0047 a p=0,0089)
Diskuse:
Metodika kvantifikace kapilár je poměrně složitá. Standardně se provádí výběr míst s největším počtem kapilár (hot spots) při malém zvětšení, která jsou následně pod větším zvětšením spočítána (přímo hodnotícím patologem nebo za použití počítačových metodik analýzy obrazu). Ve většině studií takto získané maximální hodnoty korelují s prognózou.
V některých (ojedinělých) studiích korelace nalezena nebyla, což se vysvětluje chybami v metodice a/nebo použitím ne zcela specifických markerů na imunohistochemické zobrazení endotelií. Jak z výše uvedeného vyplývá, ke zhodnocení angiogeneze v tumoru je třeba dostatečného množství tkáně k nalezení více ložisek s vyšším množstvím kapilár. V našem souboru byl při kvantifikaci kapilár pomocí endoteliálního markeru CD 31 nalezen statisticky významný rozdíl mezi vzorky pacientek bez přítomnosti invazivního tumoru v resekátu po neoadjuvantní chemoterapii a ostatními pacientkami, což ukazuje na to, že kvantifikace kapilár pomocí CD 31 je při použití modifikované metodiky prediktivním faktorem i v tak malém vzorku tkáně jakým je jehlová biopsie prsu.
Z ostatních markerů vyšla prediktivní hodnota odpovědi na chemoterapii v souladu s literárními údaji u exprese progesteronového receptoru, dále pak u onkoproteinu p53, což ve většině předchozích studií uváděno nebylo. Literárně jsou udávány jako predikční faktor také vvšší grade, vyšší proliferační aktivita, negativita exprese estrogenového receptoru a overexprese onkoproteinu HER2/neu, u nichž v našem souboru byl patrný rozdíl mezi skupinou bez reziduálního invazivního tumoru a ostatními pacientkami, ovšem nedosahoval statistické významnosti. Důvodem může být poměrně malý soubor i metodické nedostatky (markery detekované v rámci rutinního vyšetření biopsie prsu byly vyšetřovány v průběhu pěti let s postupným zdokonalováním metodiky imunohistochemického vyšetření a odečítány pěti různými patology).
Závěr:
Výsledky studie ukazují na vhodnost dalšího studia v této oblasti, zejména výsledek kvantifikace kapilár v tumoru pomocí CD31 ponouká ke zpracování problematiky ve větším souboru. Význam kvantifikace kapilár v indikaci antiangiogenní terapie (která se již používá v klinických studiích) byl zpracováván pouze částečně. U antiangiogenní terapie protilátkou proti VEGF (bevacizumab) nebyla nalezena korelace mezi počtem kapilár v tumoru před chemoterapií a odpovědí na bevacizumab. Z výsledků zpracování tohoto souboru lze usuzovat, že v případě zjištění korelace počtu kapilár v tumoru s odpovědí na některou z dalších antiangiogenních terapií, by ke zhodnocení počtu kapilár mohlo být dostatečné i množství materiálu z jehlové biopsie tumoru a bylo by tedy hypoteticky možné na základě tohoto vyšetření indikovat i neoadjuvantní antiangiogenní chemoterapii.
Literatura:
Úvod:
Zvýšená schopnost novotvorby kapilár (angioneogeneze) je u nádorových onemocnění obecně uznávaným prognostickým faktorem spojovaným s horší prognózou onemocnění. Tumory s vyšší vaskularizací mohou růst rychleji v důsledku lepšího zásobení.
Vzhledem k nedokonalosti stavby novotvořené kapilární stěny (zejména její bazální membrány) mají snadnější možnost metastazování.
K hodnocení schopnosti angiogeneze se používá jednak metodika imunohistochemické detekce a kvantifikace kapilár ve vzorku z nádorové tkáně, dále pak průkaz angiogenních působků produkovaných tumorem buď imunohistochemicky ve vzorcích nádorové tkáně, nebo sledováním jejich hladin v krvi.
V našem souboru jsme se pokusili zhodnotit možnost vyšetřování angiogeneze v materiálu z biopsie tumoru před podáním neoadjuvantní chemoterapie. Šlo o pokus o upravení metodiky kvantifikace kapilár tak, aby byla vhodná k vyšetření malých vzorků tumoru z jehlové biopsie prsu, s cílem zjistit, zda takto hodnocená angiogeneze je prediktivním faktorem odpovědi na neoadjuvantní chemoterapii. Pro zobrazení kapilár byly použity panendoteliální markery CD 31 a CD 34 a dále marker považovaný za specifický pro aktivované endotelie – CD 105 (endoglin) – součást receptoru pro angiogenní faktor TGFβ. Dále byla hodnocena exprese VEGF (vascular endothelial growth factor) produkovaného nádorovými buňkami nebo buňkami nádorového stromatu. Výsledky byly srovnávány s expresí standardně vyšetřovaných imunohistochemických markerů: estrogenových a progesteronových receptorů, proliferačního markeru Ki-67, onkoproteinu p53 a onkoproteinu HER2/neu.
Vzhledem ke korelaci patologické kompletní odpovědi s dlouhodobou prognózou přežití nemocných s karcinomem prsu po neoadjuvantní chemoterapii lze užít odpovědi na neoadjuvantní chemoterapii jako náhradního prognostického ukazatele.
Metodika:
U každé ze 73 pacientek (vybraných ze základního souboru pacientek sledovaných na Klinice onkologie a radioterapie FN Hradec Králové, léčených neoadjuvantní chemoterapií – kombinací paclitaxelu a doxorubicinu –v letech 1998-2003 na základě dostatečného množství materiálu získaného punkční biopsií nádoru) byl vyšetřován materiál z jehlové biopsie prsu nebo drobné kožní excize (u tumorů infiltrujících kůži) odebraný před podáním neoadjuvantní chemoterapie a následně resekát prsu. Materiál byl standardně zpracován, fixován formalínem a zalit v parafinu. Řezy silné 4 μm byly barveny hematoxylinem eosinem. Imunohistochemická barvení byla prováděna streptavidin-biotinovou metodou s peroxidázovým detekčním systémem (EnVision, DAKO). Použité markery: CD 31 (monoklonální, JC70A, DAKO), CD 34 (monoklonální, QBEnd 10, 1:50, DAKO), CD 105 (monoklonální, SN6h, DAKO) a VEGF (polyklonální, NeoMarkers), estrogenové receptory (1D5, DAKO), progesteronové receptory (PgR636, DAKO), Ki-67 (MIB-1, DAKO), p53 TM(DO-7, DAKO). K průkazu exprese HER2/neu byl použit kit HercepTestTM (DAKO)
Byl kvantifikován počet kapilár v nádorové tkáni. Při malém zvětšení (40x) byla vybírána místa s největším počtem kapilár, ve kterých pak při zvětšení 400x (při průměru zorného pole 0,5 mm) byly spočítány luminizované kapiláry do průměru 10 μm. Vybírána byla – vzhledem k různé velikosti hodnocených vzorků (s různým počtem ložisek s největším počtem kapilár) pouze jedna maximální hodnota. Exprese VEGF byla hodnocena v nádorových buňkách semikvantitativně (0, +, ++ a +++). Ostatní rutinně vyšetřované markery byly hodnoceny standardně (u ER a PR IRS skóre, procento Ki-67 pozitivních nádorových buněk, semikvantitativní hodnocení p53 včetně procenta pozitivních nádorových buněk a HER skóre).
Statistické hodnocení bylo provedeno Mann-Whitneyovým testem.
Výsledky:
Věk pacientek v souboru se pohyboval od 22 do 75 let, medián věku 56 let. Patologická kompletní remise (ve smyslu Chevallierovy klasifikace stupeň 1 a 2) – tedy nepřítomnost invazivního tumoru v resekátu – se vyskytla u 15 pacientek (20 %). V dalším textu čísla psaná kurzívou odpovídají počtům a procentuálním poměrům ve skupině bez přítomnosti invazivního tumoru v resekátu.
Z celkového počtu 73 tumorů bylo:53 tumorů (73 %) duktálních toho 10 ve skupině s pCR), 13 (18 %) lobulárních (z toho 1 ve skupině s pCR), 7 ostatních typů (z toho 4 ve skupině s pCR); stupeň diferenciace byl ve 3 tumorech (4 %) (1 resp. 7 %) grade 1, v 36 (49 %) (6 resp. 40 %) grade 2 a v 34 (45 %) (8 resp. 53 %) grade 3.
Medián počtu kapilár na zorné pole největšího zvětšení byl u značení endotelií pomocí CD 31 4 kapiláry (od 1 do 13)(5 kapilár od 2 do 10), pomocí CD 105 3 kapiláry (od 0 do 11) (4 kapiláry, od 0 do 8), pomocí CD 34 6 kapilár (od 2 do 17) (8 kapilár, od 3 do 11).
Exprese VEGF byla vysoká u 30 tumorů (41 %)(7, resp.47 %) , střední u 24 (33 %) (5, resp. 33 %), nízká u 12 (16 %) (1, resp.7 %) , nebyla prokázána u 7 (10 %) (2, resp.13 %)
Medián IRS skóre pro estrogenové receptory byl 6 (od 0 do 12) (2, od 0 do 12), pro progesteronové receptory 2 (od 0 do 12)(0, od 0 do 9).
Medián procenta pozitivity Ki-67 byl 20 (od 3 do 90) (25, od 10 do 80).
Exprese p53 byla vysoká u 5 tumorů (7 %) (3, resp. 20 % ), střední u 14 (19 %) (5, resp. 33 %), nízká u 9 (12 %) (2, resp.14 % ), nebyla prokázána u 45 (62 %) (5, resp.33 %).
HER skóre 0 bylo u 29 tumorů (40 %) (5, resp. 33 %), 1 u 25 (34 %) (3, resp 20 %), 2 u 9 (12 %) (2, resp. 14 %) a 3 u 10 (14 %) (5, resp. 33 %).
Statisticky významný rozdíl mezi skupinou s patologickou kompletní odpovědí a ostatními pacientkami byl nalezen u kvantifikace kapilár pomocí CD 31 (p=0,0237), u hodnocení exprese progesteronových receptorů pomocí IRS skóre (p=0,0035) a u semikvantitativního i procentuálního hodnocení exprese p53 (p=0,0047 a p=0,0089)
Diskuse:
Metodika kvantifikace kapilár je poměrně složitá. Standardně se provádí výběr míst s největším počtem kapilár (hot spots) při malém zvětšení, která jsou následně pod větším zvětšením spočítána (přímo hodnotícím patologem nebo za použití počítačových metodik analýzy obrazu). Ve většině studií takto získané maximální hodnoty korelují s prognózou.
V některých (ojedinělých) studiích korelace nalezena nebyla, což se vysvětluje chybami v metodice a/nebo použitím ne zcela specifických markerů na imunohistochemické zobrazení endotelií. Jak z výše uvedeného vyplývá, ke zhodnocení angiogeneze v tumoru je třeba dostatečného množství tkáně k nalezení více ložisek s vyšším množstvím kapilár. V našem souboru byl při kvantifikaci kapilár pomocí endoteliálního markeru CD 31 nalezen statisticky významný rozdíl mezi vzorky pacientek bez přítomnosti invazivního tumoru v resekátu po neoadjuvantní chemoterapii a ostatními pacientkami, což ukazuje na to, že kvantifikace kapilár pomocí CD 31 je při použití modifikované metodiky prediktivním faktorem i v tak malém vzorku tkáně jakým je jehlová biopsie prsu.
Z ostatních markerů vyšla prediktivní hodnota odpovědi na chemoterapii v souladu s literárními údaji u exprese progesteronového receptoru, dále pak u onkoproteinu p53, což ve většině předchozích studií uváděno nebylo. Literárně jsou udávány jako predikční faktor také vvšší grade, vyšší proliferační aktivita, negativita exprese estrogenového receptoru a overexprese onkoproteinu HER2/neu, u nichž v našem souboru byl patrný rozdíl mezi skupinou bez reziduálního invazivního tumoru a ostatními pacientkami, ovšem nedosahoval statistické významnosti. Důvodem může být poměrně malý soubor i metodické nedostatky (markery detekované v rámci rutinního vyšetření biopsie prsu byly vyšetřovány v průběhu pěti let s postupným zdokonalováním metodiky imunohistochemického vyšetření a odečítány pěti různými patology).
Závěr:
Výsledky studie ukazují na vhodnost dalšího studia v této oblasti, zejména výsledek kvantifikace kapilár v tumoru pomocí CD31 ponouká ke zpracování problematiky ve větším souboru. Význam kvantifikace kapilár v indikaci antiangiogenní terapie (která se již používá v klinických studiích) byl zpracováván pouze částečně. U antiangiogenní terapie protilátkou proti VEGF (bevacizumab) nebyla nalezena korelace mezi počtem kapilár v tumoru před chemoterapií a odpovědí na bevacizumab. Z výsledků zpracování tohoto souboru lze usuzovat, že v případě zjištění korelace počtu kapilár v tumoru s odpovědí na některou z dalších antiangiogenních terapií, by ke zhodnocení počtu kapilár mohlo být dostatečné i množství materiálu z jehlové biopsie tumoru a bylo by tedy hypoteticky možné na základě tohoto vyšetření indikovat i neoadjuvantní antiangiogenní chemoterapii.
Literatura:
- Länger F, Lück HJ, Kreipe HH: Therapieinduzierte Tumorregression beim Mammakarzinom. Pathologe 25:455-60, 2004.
- Ryška A. Angiogeneze v nádorech. Část I. Úloha v určování biologických vlastností nádoru; faktory ovlivňující vznik a vývoj angiogeneze. Čs Patol 36: 26-31, 2000.
- Ryška A, Hovorková E, Ludvíková M. Angiogeneze v nádorech. Část II. Metody a význam kvantifikace; angiogeneze jako prognostický ukazatel a cíl možných léčebných postupů. Čs Patol 36: 71-80, 2000.
- Charpin C, Dales JP, Garcia S, Carpentier S, Djemli A, Andrac L, Lavaut MN, Allasia C, Bonnier P: Tumor neoangiogenesis by CD31 and CD105 expression evaluation in breast carcinoma tissue microarrays. Clin Cancer Res 10:5815-9, 2004.
- Tuma RS: Success of bevacizumab trials raises questions for future studies. J Natl Cancer Inst 97:950-1, 2005.
Datum přednesení příspěvku: 19. 1. 2007
