Úskalí molekulární diagnostiky Ewingova sarkomu / PNET

Fúzní gen EWS/FLI1 je produktem chromozomální aberace t(1122)(q24q12) a je označovaný jako molekulární marker Ewingova sarkomu/PNET (ES/PNET), maligního nádorového onemocnění postihujícího nejčastěji pacienty ve věku do 20 let, zpravidla vyrůstá na kostech, ale může se vyskytnout i v měkkých tkáních nebo orgánech. S onemocněním ES/PNET je tento fúzní gen asociován přibližně v 90 – 95% všech případů. U nádorových buněkES/PNET bylo popsáno celkem 18 rozdílných variant fúzního genu EWS/FLI1, z nichž nejčastější je varianta, která vzniká fúzí exonu 7 EWS genu a exonu 6 FLI1 genu (v 65% případů). Ve 20% případů ES dochází ke spojení exonu 7 EWS genu k exonu 5 FLI1 genu. Ostatní varianty jsou vzácné.
Nález exprese fúzního genu EWS/FLI1 metodou RT-PCR v odebrané tkáni, krvi nebo kostní dřeni potvrzuje do 24 hodin od odběru diagnózu ES/PNET. Rychlost této informace je cenná především u pacientů ohrožených compartment syndromem v důsledku růstu nádoru v kritických lokalizacích (parézy hlavových nervů, páteřní kanál), kdy je nezbytná urgentní intervence. V případě jedoznačného výsledku tak může být systémová protinádorová terapie zahájena i bez definitivního závěru patologa. Diseminaci (mikrometastázy) nebo relaps onemocnění je možné metodou RT-PCR prokázat ještě před klinickou manifestací na základě vyšetření vzorků kostní dřeně a periferní krve senzitivní metodou dvoukolové nested RT-PCR se specifickými primery pro fúzní gen EWS/FLI1.
Metodou RT-PCR jsme v loň ském roce zachytili na našem pracovišti 7 nových pacientů s pozitivním nálezem EWS/FLI1 fúzního genu z celkem 20 vyšetřovaných pacientů se suspektní diagnózou ES. Naše zkušenosti ukazují, že pro správné interpretování výsledků detekce fúzního genu EWS/FLI1 metodou RT-PCR je někdy nutné přistoupit k dalším sekvenačním analýzám amplifikovaných PCR-produktů. Pomocí sekvenace PCR-produktu jsme detekovali u jednoho pacienta vzácnou variantu fúzního genu EWS/FLI1, u které došlo k fúzi exonu 9 EWS genu a exonu 6 FLI1 genu. U dalšího pacienta jsme nádorové onemocnění vyloučili, neboť sekvenační analýza prokázala, že během RT-PCR došlo k amplifikaci kontaminující genomické DNA. Polymorfismus intronové oblasti EWS genu u tohoto pacienta byl příčinou anealingu primeru komplementárního k sekvenci FLI1 genu. Naopak u třetího pacienta byl fúzní gen EWS/FLI1 detekován až při zvýšení senzitivity metody druhým kolem PCR, histologický závěr našemu nálezu odpovídal – nekrotická tkáň jejíž nádorovou etiologii nelze potvrdit ani vyloučit. Po potvrzení sekvenční specifity tohoto PCR-produktu byl pacient indikován k novému odběru nádoru. RT-PCR vyšetření rebiopsie, která byla směrován hlouběji do tumoru, onemocnění ES/PNET u pacienta jednoznačně potvrdilo. S našimi výsledky kontrolního odběru u tohoto pacienta koreluje rovněž závěr patologa.
Publikovaná senzitivita dvoukolové nested RT-PCR metody odpovídá záchytu 1 pozitivní buňky nesoucí fúzní gen EWS/FLI1 mezi 10⁵ až 10⁶ normálních buněk. Specificita metody je však v některých případech zatížena chybou, která je nejčastěji způsobena kontaminací vyšetřované RNA genomickou DNA, případně vůbec kvalitou výchozího odebraného materiálu. Možným řešením by bylo zavedení metody real-time RT-PCR, která by umožnila zvýšit přesnost metody přidáním sekvenčně specifické sondy do reakce.