Účinky bortezomibu na buněčné linie karcinomu prsu

Úvod: Bortezomib je novým chemoterapeutikem určeným pro léčbu maligního myelomu, které selektivně inhibuje proteasom specifickou reverzibilní interakcí. V preklinických studiích se prokázal vliv bortezomibu in vitro na buněčné nádorové linie řady nádorů (non-Hodgkinské lymfomy, nádory ovaria, pankreatu či chronickou lymfatickou leukémii). Po aplikaci bortezomibu dochází u nenádorových buněk k zástavě buněčného cyklu, u nádorových buněk často dochází k aktivaci apoptózy. Předpokládá se, že klíčovým faktorem inhibice proteasomu je ovlivnění signalizace transkripčního faktoru NF-κB. V poslední době se studuje použití bortezomibu také pro léčbu solidních nádorů.
Cíle: Cílem práce byla evaluace účinku bortezomibu u vybraných linií karcinomu prsu, zhodnocení jeho vlivu na alterace buněčného cyklu či aktivaci apoptózy a charakterizace změn genové exprese indukovaných bortezomibem.
Metody: Pro práci byly použity čtyři buněčné linie karcinomu prsu: MCF-7, MDA-MB231, HCC1937 a EM-G3. Růstové charakteristiky linií ovlivněných bortezomibem byly stanoveny MTT testem chemosenzitivity. Předléčené buňky byly použity pro analýzu buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie (FACS Calibur) a izolaci celkové RNA (ArrayGrade Total RNA Izolation Kit). Izolovaná celková RNA sloužila jako templát pro syntézu cDNA pomocí SuperScript III (Invitrogene). Účinky bortezomibu na změny genové exprese byly stanoveny pomocí cRNA arrayí zaměřených na signální dráhu NF-κB a apoptózu (SuperArray) a u vybraných genů validovány pomocí kvantitativního RT-PCR v reálném čase (qPCR; Roche).
Výsledky: Po aplikaci bortezomibu došlo u všech analyzovaných linií k indukci apoptózy, která byla nejmarkantnější v případě linií HCC1937 a MDA-MB231 (zvýšení až o 20%), a zástavě buněčného cyklu. Rozvoj apoptózy po aplikaci bortezomibu se u studovaných linií pohyboval od 4 do 6 dní v koncentracích 2–6 ng/ml. S výjimkou linie MDA-MB231 způsobovala koncentrace bortezomibu 1ng/ml < 50 % inhibici růstu buněk.

Vyšetření genové exprese pomocí NF-κB arrayí prokázalo významné zvýšení exprese A20
(TNFAIP3), DR4 (TNFRSF10A) a TRADD doprovázené u linie EM-G3 zvýšením TNFαR (TNFRSF1A). Kromě těchto změn ukázaly NF-κB arraye individuální rozdíly v reakci studovaných buněčných linií na aplikaci bortezomibu: U ošetřených linií EM-G3, HCC1937 a MCF-7 došlo k výraznému snížení exprese genů FOS a EGR1. U linií HCC1937 a EM-G3 došlo k významnému zvýšení exprese genů pro IL-8, GJA1 (connexin 43) a Rel-B. U linií HCC1937 a MCF-7 byl u ošetřených buněk silněji exprimován IL-6. U vybraných genů s výraznou změnou v arrayi byla hodnocena jejich exprese pomocí qPCR. Po aplikaci bortezomibu se u linie EM-G3 prokázalo statisticky významné několikanásobné snížení exprese genů EGR 1 (11×) a FOS(13×) oproti kontrolním buňkám. U linie HCC1937 došlo po aplikaci vyšší koncentrace k několikanásobnému zvýšení exprese genů GJA1 (200×), IL-6 (20×), IL-8 (23×) a NF-κB2 (8x). U linie MDA-MB231 po ošetření vyšší koncentrací došlo k výraznému statisticky významnému snížení exprese genu GJA1 (240x) a mírnému, ale signifikantnímu poklesu exprese NF-κB2 (2,5×; p = 0,001).
Z celkem 112 vyšetřovaných genů regulujících proces apoptózy se 43 exprimovalo ve všech studovaných liniích. Změny v transkripci jednotlivých genů byly různé u hodnocených linií. Nápadná změna v expresi se projevila např. u tumor supresorového genu p53. qPCR analýza exprese p53 ukázala, že u linie HCC1937 dochází k několikanásobnému zvýšení exprese (50×), naopak ke snížení exprese došlo u linií MDA-MB231 (200×) a MCF-7 (4×).

Závěr: Výsledky analýz ukazují, že všechny studované linie jsou senzitivní na účinky bortezomibu in vitro. Zajímavým zjištěním je významné zvýšení exprese A20, negativního regulátoru NF-κB, a genů zúčastněných v modulaci signálu zprostředkovaného zástupci rodiny TNFR (DR4, TNFαR). Tyto změny mohou vést k ovlivnění biologické aktivity NF-κB jiným mechanizmem, než je popisovaná inhibice jeho aktivity na základě aktivity IκB. Mimo tento společný jmenovatel je pravděpodobné, že účinek bortezomibu u jednotlivých linií je modulován různými mechanizmy. Nejasné je významné zvýšení exprese IL-8 a IL-6 (qPCR: 20–1000×) a jejich úloha v buňkách mamárního karcinomu.

Práce byla podpořena granty IGA MZČR 8456-4 a IGA MZČR 8145-3.