Konference: 2009 XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Zhoubné nádory prsu
Téma: V. Onkopatologie
Číslo abstraktu: 055p
Autoři: Zina Hanzelková; Iva Horáková
Gen HER2/neu je protoonkogen umístěný na dlouhém
raménku 17. chromozomu (17pl2) a kóduje expresi transmembránového
glykoproteinu, který patří do rodiny epidermálních růstových
receptorů s tyrosin-kinázovou aktivitou. Amplifikaci oblasti
chromozomu, kde se gen HER2/neu vyskytuje, lze nalézt u celé řady
nádorových onemocnění včetně karcinomu prsu.
Amplifikace genu HER2/neu u karcinomu prsu je významný prognostický faktor, spojený se signifikantně horším přežíváním u pacientek s metastatickým karcinomem prsu. Je prediktivní faktorem odpovědi na léčbu monoklonální anti-HER2 protilátkou trastuzumabem (Herceptin®) ale také na chemoterapii a hormonální terapii. Léčba trastuzumabem má prokázaný klinický efekt u metastatického mammárního karcinomu, ale i u pacientek s časným karcinomem prsu, kde se při adjuvantní léčbě trastuzumabem uvádí přibližně o 50% nižší riziko vzniku relapsu.
Detekce HER2/neu v karcinomu mléčné žlázy je možná bud imunohistochemickým průkazem overexprese proteinu v nádorových buňkách nebo stanovením amplifikace genu.
Na našem pracovišti je rutinně prováděno skríningové vyšetření overexprese proteinu HER2 u všech karcinomů mammy, a to jak u nově diagnostikovaných, tak i u recidiv a metastáz.
Na základě pozitivní overexprese proteinu HER2 je nádorová tkáň dále vyšetřena metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) ke stanovení amplifikace genu HER2/neu. Kromě pacientek bioptovaných v našem ústavu poskytujeme tato vyšetření i několika dalším pracovištím patologie. Metoda FISH je konfirmační metodou před léčbou Herceptinem.
Princip metody FISH je založen na párování jedno vláknové fluorescenčně značené DNA sondy (proby) s komplementárními cílovými sekvencemi ve vyšetřované DNA. V naší laboratoři jsme vyzkoušeli sondy několika výrobců: Genetica, Vysis, Dako, a v současné době používáme sondu firmy Kreatech, se kterou máme prozatím nejlepší zkušenosti. Metodou FISH lze zpracovávat různé typy vzorků (otisky, cytospiny, parafinové řezy, krevní nátěry, mitotické preparáty). Testovali jsme metodu otisků, ale vzhledem k nutnému morfologickému hodnocení vyšetřované nádorové tkáně zpracováváme řezy z formol-parafinových tkáňových bloků. Tkáňové řezy je nutné pro metodu FISH připravit jejich odparafinováním, inkubací v HCl, v kyanidu, následným natrávením proteázou, postfixací a vysušením preparátů. Během vlastní FISH nakapeme na připravené řezy fluorescenčně značenou probu firmy Kreatech, která obsahuje fluorescenčně značenou centromerickou sondu pro chromozom 17 a fluorescenčně značenou lokus specifickou sondu pro oblast genu HER2/neu. Po nakapání proby preparáty denaturujeme zvýšením teploty a hybridizujeme přes noc. Následující den se odmývá nenavázaná sonda a dobarvují se jádra DNA interkalačním barvivem DAPI.
V celém procesu se vyskytují kritická místa, která mohou ovlivnit konečný výsledek, a to jak při přípravě vzorků pro hybridizaci tak i během vlastní metody FISH. Nejčastějšími chybami při přípravě vzorků, bývají neformolová fixace, protrahovaná formolová fixace, krátká doba inkubace v kyanidu a nesprávná doba trávení proteázou. V průběhu FISH je důležité dodržet správnou teplotu a délku denaturace, hybridizace i odmytí, preparáty také nesmí během hybridizace vyschnout. Chyby se mohou projevit slabými signály nebo jejich úplnou absencí, špatnou morfologii tkáně, vysokou autofluorescencí nebo nečistotami na pozadí.
Zpracované tkáňové řezy hodnotíme ve fluorescenčním mikroskopu Olympus BX 51s použitím barevných filtrů a imerzního objektivu při zvětšení 400x a lOOOx. Ve vybraných úsecích invazivního tumoru s nepřekrývajícími se jádry a dobře patrnými oběma typy signálů hodnotíme minimálně rutinně 60-100 buněk. Elektronickou archivaci provádíme nasnímáním preparátu pomocí monochromatické kamery a obrazové analýzy. Skla s preparáty se archivují po dobu jednoho roku při teplotě - 20°C, po této době signály většinou již nejsou patrné. Amplifikaci genu HER2/neu stanovujeme podle poměru počtu centromerických a lokus specifických signálů takto: poměr pod 1,8 - bez amplifikace; 1,8 až 2,2 - hraniční amplifikace; nad 2,2 - amplifikace.
Od roku 2004 dosud jsme metodou FISH rutinně vyšetřili 670 karcinomů mammy, u 350 z nich byla nalezena amplifikace genu HER2/neu. 22% vyšetřených tumorů pocházelo z mimoústavních pracovišť. U 3% pacientek se stav genu HER2/neu nepodařilo vyšetřit, a to většinou vinou protahované formolové fixace nebo spotřebováním tumoru ve vzorku během zpracování při minimálním objemu invazivního karcinomu. Shoda mezi nalezenou silnou overexpresí proteinu HER2 (3+) a amplifikací genu HER2/neu dosáhla 97,4%. Více než třetina (33,8%) amplifikovaných karcinomů se vyskytovala u pacientek ve věkové kategorii 50 až 60 let. U 91% karcinomů byly na našem pracovišti vyšetřeny imunohistochemicky současně i steroidní receptory, pozitivní estrogenové receptory s amplifikací genu HER2/neu byly nalezeny u 56% vyšetřených případů.
Fluorescenční in situ hybridizace je velmi spolehlivá a snadno reprodukovatelná metoda ke stanovení amplifikace genu HER2/neu, která ale jednoznačně vyžaduje specializované technické zázemí, větší soubor pacientů, zkušené a edukované laborantky a pro hodnocení erudované patology.
Amplifikace genu HER2/neu u karcinomu prsu je významný prognostický faktor, spojený se signifikantně horším přežíváním u pacientek s metastatickým karcinomem prsu. Je prediktivní faktorem odpovědi na léčbu monoklonální anti-HER2 protilátkou trastuzumabem (Herceptin®) ale také na chemoterapii a hormonální terapii. Léčba trastuzumabem má prokázaný klinický efekt u metastatického mammárního karcinomu, ale i u pacientek s časným karcinomem prsu, kde se při adjuvantní léčbě trastuzumabem uvádí přibližně o 50% nižší riziko vzniku relapsu.
Detekce HER2/neu v karcinomu mléčné žlázy je možná bud imunohistochemickým průkazem overexprese proteinu v nádorových buňkách nebo stanovením amplifikace genu.
Na našem pracovišti je rutinně prováděno skríningové vyšetření overexprese proteinu HER2 u všech karcinomů mammy, a to jak u nově diagnostikovaných, tak i u recidiv a metastáz.
Na základě pozitivní overexprese proteinu HER2 je nádorová tkáň dále vyšetřena metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) ke stanovení amplifikace genu HER2/neu. Kromě pacientek bioptovaných v našem ústavu poskytujeme tato vyšetření i několika dalším pracovištím patologie. Metoda FISH je konfirmační metodou před léčbou Herceptinem.
Princip metody FISH je založen na párování jedno vláknové fluorescenčně značené DNA sondy (proby) s komplementárními cílovými sekvencemi ve vyšetřované DNA. V naší laboratoři jsme vyzkoušeli sondy několika výrobců: Genetica, Vysis, Dako, a v současné době používáme sondu firmy Kreatech, se kterou máme prozatím nejlepší zkušenosti. Metodou FISH lze zpracovávat různé typy vzorků (otisky, cytospiny, parafinové řezy, krevní nátěry, mitotické preparáty). Testovali jsme metodu otisků, ale vzhledem k nutnému morfologickému hodnocení vyšetřované nádorové tkáně zpracováváme řezy z formol-parafinových tkáňových bloků. Tkáňové řezy je nutné pro metodu FISH připravit jejich odparafinováním, inkubací v HCl, v kyanidu, následným natrávením proteázou, postfixací a vysušením preparátů. Během vlastní FISH nakapeme na připravené řezy fluorescenčně značenou probu firmy Kreatech, která obsahuje fluorescenčně značenou centromerickou sondu pro chromozom 17 a fluorescenčně značenou lokus specifickou sondu pro oblast genu HER2/neu. Po nakapání proby preparáty denaturujeme zvýšením teploty a hybridizujeme přes noc. Následující den se odmývá nenavázaná sonda a dobarvují se jádra DNA interkalačním barvivem DAPI.
V celém procesu se vyskytují kritická místa, která mohou ovlivnit konečný výsledek, a to jak při přípravě vzorků pro hybridizaci tak i během vlastní metody FISH. Nejčastějšími chybami při přípravě vzorků, bývají neformolová fixace, protrahovaná formolová fixace, krátká doba inkubace v kyanidu a nesprávná doba trávení proteázou. V průběhu FISH je důležité dodržet správnou teplotu a délku denaturace, hybridizace i odmytí, preparáty také nesmí během hybridizace vyschnout. Chyby se mohou projevit slabými signály nebo jejich úplnou absencí, špatnou morfologii tkáně, vysokou autofluorescencí nebo nečistotami na pozadí.
Zpracované tkáňové řezy hodnotíme ve fluorescenčním mikroskopu Olympus BX 51s použitím barevných filtrů a imerzního objektivu při zvětšení 400x a lOOOx. Ve vybraných úsecích invazivního tumoru s nepřekrývajícími se jádry a dobře patrnými oběma typy signálů hodnotíme minimálně rutinně 60-100 buněk. Elektronickou archivaci provádíme nasnímáním preparátu pomocí monochromatické kamery a obrazové analýzy. Skla s preparáty se archivují po dobu jednoho roku při teplotě - 20°C, po této době signály většinou již nejsou patrné. Amplifikaci genu HER2/neu stanovujeme podle poměru počtu centromerických a lokus specifických signálů takto: poměr pod 1,8 - bez amplifikace; 1,8 až 2,2 - hraniční amplifikace; nad 2,2 - amplifikace.
Od roku 2004 dosud jsme metodou FISH rutinně vyšetřili 670 karcinomů mammy, u 350 z nich byla nalezena amplifikace genu HER2/neu. 22% vyšetřených tumorů pocházelo z mimoústavních pracovišť. U 3% pacientek se stav genu HER2/neu nepodařilo vyšetřit, a to většinou vinou protahované formolové fixace nebo spotřebováním tumoru ve vzorku během zpracování při minimálním objemu invazivního karcinomu. Shoda mezi nalezenou silnou overexpresí proteinu HER2 (3+) a amplifikací genu HER2/neu dosáhla 97,4%. Více než třetina (33,8%) amplifikovaných karcinomů se vyskytovala u pacientek ve věkové kategorii 50 až 60 let. U 91% karcinomů byly na našem pracovišti vyšetřeny imunohistochemicky současně i steroidní receptory, pozitivní estrogenové receptory s amplifikací genu HER2/neu byly nalezeny u 56% vyšetřených případů.
Fluorescenční in situ hybridizace je velmi spolehlivá a snadno reprodukovatelná metoda ke stanovení amplifikace genu HER2/neu, která ale jednoznačně vyžaduje specializované technické zázemí, větší soubor pacientů, zkušené a edukované laborantky a pro hodnocení erudované patology.
Datum přednesení příspěvku: 16. 4. 2009
