Konference: 2010 XXXIV. Brněnské onkologické dny a XXIV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Postery
Číslo abstraktu: 224p
Autoři: Mgr. Olga Krupková; E. Možná; MUDr. Karel Zitterbart, Ph.D.; prof. MUDr. Jaroslav Štěrba, CSc.; doc.RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Úvod
Nestin je protein VI. třídy intermediárních filament, který je v současné době považován za důležitý marker neuronálních kmenových/progenitorových buněk. Nestin se nachází ve vyvíjejících se živočišných buňkách nervové soustavy v 6.-40. týdnu embryogeneze. Jeho exprese je na počátku vývoje vysoká, ale se zvyšujícím se stupněm diferenciace buněk nervové soustavy podíl nestinu rapidně klesá a po narození je jeho výskyt omezen převážně na oblast subventrikulární zóny mozkových komor. Tato oblast je považována za místo vzniku nových neuronů během celého života jedince, tedy za místo lokalizace neuronálních kenových buněk. V dospělém organizmu byl nestin rovněž detekován v místech poškození centrální nervové soustavy (CNS) a v nádorově transformovaných buňkách různých typů solidních nádorů. Panuje obecný názor, že nestin může hrát důležitou roli během proliferace či diferenciace nádorových buněk nebo při procesu metastzování, tato úloha nestinu v nádorových buňkách však není dosud objasněna [1,2,3]. Bylo prokázáno, že míra jeho exprese v určitých typech nádorů koreluje s maligním potenciálem buněk, tedy s jejich primitivitou, a rovněž byla potvrzena exprese nestinu ve vaskulárních endoteliálních buňkách během nádorové angiogeneze. Tato korelace má prognostický význam u astrocytických nádorů a melanomu, avšak není absolutní a neplatí pro všechny typy nádorů, ve kterých byl nestin nalezen. V současné době je nestin považován za jeden z markerů nádorovách kmenových buněk zejména neurogenních nádorů. Těmto předpokladům odpovídají současné výsledky, které potvrdily koexpresi nestinu a molekuly CD133 v určité frakci nádorově transformovaných buněk [4]. Kromě standardní cytoplazmatické lokalizace byl nestin detekován také v buněčných jádrech několika typů solidních nádorů. Jedná se o nález nestinu v jádře astrocytomu, angiosarkomu a neuroblastomu, kde byla rovněž prokázána jeho interakce s jadernou DNA [4,5,6]. Následující výzkum však tuto interakci nepotvrdil [7], otázka lokalizace nestinu v jádře a jeho interakce s DNA tedy zůstává nadále otevřená. Hlavním cílem bylo ověřit intracelulární distribuci nestinu (cytoplazma vs. jádro) u vybraných nádorových liniích neurogenního původu (neuroblastom, meduloblastom, multiformní glioblastom).
Materiál a metody
Subcelulárni lokalizace nestinu byla hodnocena u 13 buněčných linií derivovaných ze solidních neurogenních nádorů operovaných ve FN Brno - konkrétně z multiformního glioblastomu (6 linií), meduloblastomu (2 linie) a neuroblastomu (5 linií). Nestin byl detekován metodou nepřímé imunofluorescence: jako primární protilátka byla použita myší monoklonální protilátka proti nestinu (MAB5326, Chemicon) v ředění 1:100 v 2% BSA. Jako sekundární byla použita antimyší protilátka konjugovaná s FITC (anti-M IGg FITC, F-8521, Sigma) v ředění 1:120 v 2% BSA. Preparáty byly hodnoceny pomocí fluorescenčního mikroskopu Olympus BX-61, fotografie byly pořizovány pomocí CCD kamery Vosskuhler 1300D a dále zpracovány pomocí programu Lucia 4.2.9 (Laboratory Imaging).
Výsledky
Pomocí metody nepřímé imunoflorescence byla potvrzena exprese nestinu ve všech třinácti studovaných buněčných liniích derivovaných z multiformního glioblastomu, meduloblastomu a neuroblastomu. Přítomnost nestinu v těchto liniích je v souladu s neurogenním původem nádorů a ukazuje na přítomnost primitivních, nediferencovaných, nádorových buněk.
Všechny zkoumané multiformní glioblastomy byly definovány jako high-grade (III-IV), není proto překvapující, že z nich derivované linie nestin v cytoplazmě obsahují. Tento nález koreluje s předchozími studiemi, které ukazují vysokou expresi nestinu ve velkém procentu nádorových buněk u high-grade astrocytomů, tedy jeho prognostický význam [8]. Všechny linie, až na linii GM7, vykazovaly podobné parametry (rychlost růstu, velikost a tvar buněk, obsah nestinu). Linie GM7 je na rozdíl od ostatních linií derivovaná z rekurentní nádorové tkáně odebírané pacientovi ve stádiu relapsu onemocnění, proto vykazuje některé odlišné vlastnosti (vyšší proliferační aktivita, odlišná exprese nestinu).
V linii derivované z klasického meduloblastomu (MBL-03) byl nestin detekován pouze v cytoplazmě, a to ve formě vláken. Prognostický význam nestinu u meduloblastomu byl v minulosti studován, ale nebyl doposud potvrzen [9]. Kontrolní sbírková linie DAOY, která byla rovněž derivována z meduloblastomu, nestin v cytoplazmě obsahuje, v jádrech nikoli.
Některé dřívější výsledky naznačovaly, že zvýšený obsah nestinu by mohl být společně s amplifikací MYCN v neuroblastomech markerem horší prognózy [5]. Novější výsledky však ukazují, že přímá souvislost mezi přitomností nestinu a amplifikací MYCN (tedy agresivitou neuroblastomu) zřejmě neexistuje - v neuroblastomových liniích byla detekována značně variabilní exprese nestinu. Nejintenzivněji nestin v cytoplazmě exprimovala linie NBL-17, která byla bez amplifikace MYCN a vykazovala nejrychlejší proliferaci. V nediferencovaných neuroblastomech naopak nestin dosahoval nízké intenzity signálu (NBL-19, NBL-22). Lokalizace nestinu v buněčných jádrech byla detekována u tří linií - GM7, NBL-06 a NBL-19. Tato exprese byla slabá a objevovala se ojediněle, u malého procenta buněk. V buňkách, které v cytoplazmě mají intenzivně značená vlákna, nebyl nestin v jádře nikdy zaznamenán.
Závěr
Z dané práce vyplývá, že přítomnost nestinu v jádrech není kauzálně spojena s žádným sledovaným cytogenetickým nálezem, souvisí však s difuzním stavem nestinu v cytoplazmě. Výskyt nestinu v buněčných jádrech dosud není spolehlivě vysvětlen - zřejmě bude výsledkem deregulovaných mechanizmů jaderného transportu v nádorech.
Tato studie byla podpořena granty VZ MSM 0021622415, IGA MZCR NR/9125-4 2006 a MUNI/a/0090/2009-1163.
Reference
Nestin je protein VI. třídy intermediárních filament, který je v současné době považován za důležitý marker neuronálních kmenových/progenitorových buněk. Nestin se nachází ve vyvíjejících se živočišných buňkách nervové soustavy v 6.-40. týdnu embryogeneze. Jeho exprese je na počátku vývoje vysoká, ale se zvyšujícím se stupněm diferenciace buněk nervové soustavy podíl nestinu rapidně klesá a po narození je jeho výskyt omezen převážně na oblast subventrikulární zóny mozkových komor. Tato oblast je považována za místo vzniku nových neuronů během celého života jedince, tedy za místo lokalizace neuronálních kenových buněk. V dospělém organizmu byl nestin rovněž detekován v místech poškození centrální nervové soustavy (CNS) a v nádorově transformovaných buňkách různých typů solidních nádorů. Panuje obecný názor, že nestin může hrát důležitou roli během proliferace či diferenciace nádorových buněk nebo při procesu metastzování, tato úloha nestinu v nádorových buňkách však není dosud objasněna [1,2,3]. Bylo prokázáno, že míra jeho exprese v určitých typech nádorů koreluje s maligním potenciálem buněk, tedy s jejich primitivitou, a rovněž byla potvrzena exprese nestinu ve vaskulárních endoteliálních buňkách během nádorové angiogeneze. Tato korelace má prognostický význam u astrocytických nádorů a melanomu, avšak není absolutní a neplatí pro všechny typy nádorů, ve kterých byl nestin nalezen. V současné době je nestin považován za jeden z markerů nádorovách kmenových buněk zejména neurogenních nádorů. Těmto předpokladům odpovídají současné výsledky, které potvrdily koexpresi nestinu a molekuly CD133 v určité frakci nádorově transformovaných buněk [4]. Kromě standardní cytoplazmatické lokalizace byl nestin detekován také v buněčných jádrech několika typů solidních nádorů. Jedná se o nález nestinu v jádře astrocytomu, angiosarkomu a neuroblastomu, kde byla rovněž prokázána jeho interakce s jadernou DNA [4,5,6]. Následující výzkum však tuto interakci nepotvrdil [7], otázka lokalizace nestinu v jádře a jeho interakce s DNA tedy zůstává nadále otevřená. Hlavním cílem bylo ověřit intracelulární distribuci nestinu (cytoplazma vs. jádro) u vybraných nádorových liniích neurogenního původu (neuroblastom, meduloblastom, multiformní glioblastom).
Materiál a metody
Subcelulárni lokalizace nestinu byla hodnocena u 13 buněčných linií derivovaných ze solidních neurogenních nádorů operovaných ve FN Brno - konkrétně z multiformního glioblastomu (6 linií), meduloblastomu (2 linie) a neuroblastomu (5 linií). Nestin byl detekován metodou nepřímé imunofluorescence: jako primární protilátka byla použita myší monoklonální protilátka proti nestinu (MAB5326, Chemicon) v ředění 1:100 v 2% BSA. Jako sekundární byla použita antimyší protilátka konjugovaná s FITC (anti-M IGg FITC, F-8521, Sigma) v ředění 1:120 v 2% BSA. Preparáty byly hodnoceny pomocí fluorescenčního mikroskopu Olympus BX-61, fotografie byly pořizovány pomocí CCD kamery Vosskuhler 1300D a dále zpracovány pomocí programu Lucia 4.2.9 (Laboratory Imaging).
Výsledky
Pomocí metody nepřímé imunoflorescence byla potvrzena exprese nestinu ve všech třinácti studovaných buněčných liniích derivovaných z multiformního glioblastomu, meduloblastomu a neuroblastomu. Přítomnost nestinu v těchto liniích je v souladu s neurogenním původem nádorů a ukazuje na přítomnost primitivních, nediferencovaných, nádorových buněk.
Všechny zkoumané multiformní glioblastomy byly definovány jako high-grade (III-IV), není proto překvapující, že z nich derivované linie nestin v cytoplazmě obsahují. Tento nález koreluje s předchozími studiemi, které ukazují vysokou expresi nestinu ve velkém procentu nádorových buněk u high-grade astrocytomů, tedy jeho prognostický význam [8]. Všechny linie, až na linii GM7, vykazovaly podobné parametry (rychlost růstu, velikost a tvar buněk, obsah nestinu). Linie GM7 je na rozdíl od ostatních linií derivovaná z rekurentní nádorové tkáně odebírané pacientovi ve stádiu relapsu onemocnění, proto vykazuje některé odlišné vlastnosti (vyšší proliferační aktivita, odlišná exprese nestinu).
V linii derivované z klasického meduloblastomu (MBL-03) byl nestin detekován pouze v cytoplazmě, a to ve formě vláken. Prognostický význam nestinu u meduloblastomu byl v minulosti studován, ale nebyl doposud potvrzen [9]. Kontrolní sbírková linie DAOY, která byla rovněž derivována z meduloblastomu, nestin v cytoplazmě obsahuje, v jádrech nikoli.
Některé dřívější výsledky naznačovaly, že zvýšený obsah nestinu by mohl být společně s amplifikací MYCN v neuroblastomech markerem horší prognózy [5]. Novější výsledky však ukazují, že přímá souvislost mezi přitomností nestinu a amplifikací MYCN (tedy agresivitou neuroblastomu) zřejmě neexistuje - v neuroblastomových liniích byla detekována značně variabilní exprese nestinu. Nejintenzivněji nestin v cytoplazmě exprimovala linie NBL-17, která byla bez amplifikace MYCN a vykazovala nejrychlejší proliferaci. V nediferencovaných neuroblastomech naopak nestin dosahoval nízké intenzity signálu (NBL-19, NBL-22). Lokalizace nestinu v buněčných jádrech byla detekována u tří linií - GM7, NBL-06 a NBL-19. Tato exprese byla slabá a objevovala se ojediněle, u malého procenta buněk. V buňkách, které v cytoplazmě mají intenzivně značená vlákna, nebyl nestin v jádře nikdy zaznamenán.
Závěr
Z dané práce vyplývá, že přítomnost nestinu v jádrech není kauzálně spojena s žádným sledovaným cytogenetickým nálezem, souvisí však s difuzním stavem nestinu v cytoplazmě. Výskyt nestinu v buněčných jádrech dosud není spolehlivě vysvětlen - zřejmě bude výsledkem deregulovaných mechanizmů jaderného transportu v nádorech.
Tato studie byla podpořena granty VZ MSM 0021622415, IGA MZCR NR/9125-4 2006 a MUNI/a/0090/2009-1163.
Reference
- DAHLSTRAND J, COLLINS VP, LENDAHL U. Expression of the class VI intermediate filament nestin in human central nervous system tumors. Cancer Res 1992a; 52: 5334-5341.
- EHRMANN J, KOLAR Z, MOKRY J. Nestin as a diagnostic and
prognostic marker: immunohistochemical analysis of its
expression in different tumours. J Clin Pathol 2005; 58: 222-223 - KOLAR Z, EHRMANN J Jr., TURASHVILI G, BOUCHAL J, MOKRY J. A novel myoepithelial/progenitor cell marker in the breast? Virchows Arch 2007; 450: 607-609
- LOJA T, CHLAPEK P, KUGLIK P, PESAKOVA M, OLTOVA Aet al. Characterization of a GM7 glioblastoma cell line showing CD133 positivity and both cytoplasmic and nuclear localization of nestin. Oncol Rep 2009; 21: 119-27
- THOMAS SK, MESSAM CA, SPENGLER BA, BIEDLER JL, ROSS RA. Nestin
is a potential mediator of malignancy in
human neuroblastoma cells. J Biol Chem 2004; 279: 27994-27999. - VESELSKA R, KUGLIK P, CEJPEK P, SVACHOVA H, NERADIL J et al. Nestin expression in the cell lines derived from glioblastoma multiforme. BMC Cancer 2006; 6: 32
- KORJA M, FINNE J, SALMI TT, KALIMO H, KARIKOSKI R et al. Chromogenic in situ hybridization-detected hotspot MYCN amplification associates with Ki-67 expression and inversely with nestin expression in neuroblastomas. Mod Pathol 2005; 18: 1599-1605
- SCHIFFER D, MANAZZAA, TAMAGNO I. Nestin expression in neuroepithelial tumors. Neurosci Lett 2006; 400: 80-85
- RANI SB, MAHADEVAN A, ANILKUMAR SR, RAJI TR, SHANKAR SK. Expression of nestin - a stem cell associated intermediate filament in human CNS tumours. Indian J Med Res 2006; 124: 269-280.
Datum přednesení příspěvku: 22. 4. 2010
