STUDIUM KLONÁLNÍ KOMPOZICE CHRONICKÉ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKEMIE S VÍCEČETNÝMI IMUNOGLOBULINOVÝMI PŘESTAVBAMI NA ÚROVNI JEDNOTLIVÝCH BUNĚK

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je obecně monoklonální nádorové onemocnění vznikající z jediného B lymfocytu charakterizovaného jednou unikátní produktivní přestavbou imunoglobulinového lokusu IGH (P-IGH). Přesto bývají při rutinní diagnostice ve 2-5 % případů zachyceny vícečetné klonální P-IGH. Byly popsány dvě příčiny tohoto jevu: 1) porucha alelické exkluze vedoucí k epresi dvou P-IGH v jedné buňce a 2) koexistence několika leukemických klonů s odlišnými P-IGH. Ve 29 % případů CLL s vícečetnými P-IGH jsme prokázali koexistenci minimálně dvou leukemických klonů pomocí multiparametrické průtokové cytometrie (Plevova et al, Haematologica 2014). Ve zbývajících případech však nebylo možné více leukemických populací podle imunofenotypu rozlišit. Abychom zjistili, zda i v případech s homogenním imunofenotypem došlo k současné expanzi více leukemických klonů, vyvinuli jsme techniku umožňující charakterizaci jednotlivých buněk. Pacienti s vícečetnými P-IGH byli vybráni ze souboru celkem 1 513 pacientů s CLL, u kterých byly vyšetřeny imunoglobulinové přestavby v rámci rutinní diagnostiky. U vybraných vzorků byla pomocí průtokové cytometrie stanovena exprese povrchových markerů CD5, CD19, CD20, CD23, CD43, CD45, sIgK, sIgL a FMC7. Pacienti, u kterých počet klonálních P-IGH převyšoval počet rozlišených CLL populací, byli testováni na úrovni jednotlivých buněk - z periferní krve byly separovány B lymfocyty, které byly sortovány po jedné buňce do 96jamkových PCR desek s lyzačním pufrem, následovala 2kolová multiplexní RT-PCR pro současnou analýzu přestaveb lokusů IGH, IGK a IGL, kapilární elektroforéza a Sangerovo sekvenování. Vícečetné P-IGH jsme zachytili v 76/1 513 (5,0 %) CLL případů. Ve 25/38 (66 %) případů počet P-IGH převýšil počet rozlišených leukemických populací. Analýza jednotlivých buněk byla provedena ve 22/25 případů. Medián testovaných jamek na pacienta byl 92 s mediánem počtu jamek pozitivních pro P-IGH 83 %. V žádném z testovaných pacientů ani ve dvou kontrolách (pacienti s potvrzenou víceklonální CLL) nebyly detekovány buňky s více než jednou P-IGH. V 18/22 případů byla potvrzena expanze více leukemických klonů. Byla stanovena kompletní sestava těžkých a lehkých řetězců pro jednotlivé klony. Ve 4/22 případů jsme úspěšně charakterizovali pouze jeden leukemický klon, pravděpodobně kvůli nedostatečnému zastoupení minoritního klonu ve vzorku. Touto prací dokazujeme, že oligoklonalita je nejčastější příčinou exprese vícečetných P-IGH u CLL, a to i v případech s homogenním imunofenotypem. Projekt byl podpořen z grantu MZ ČR AZV 15-30015A.