STUDIUM INTERAKCE CISPLATINY S DNA POMOCÍ SANGEROVA SEKVENOVÁNÍ

Východiska:

V roce 1965 bylo objeveno biologické působení prvního platinového cytostatika - cisplatiny, která je stále jednou z nejčastěji používaných cytostatických látek. V této práci byla využita Sangerova metoda sekvenování spojená s CE pro analýzu Pt-DNA aduktů jako další alternativa kvantifikace plati­nového cytostatika interkalovaného do DNA.

Materiál a metody:

Roztok fragmentu DNA (498 bp) byl smíchán s cisplatinou o různých koncentracích v pro­středí 10 mM NaClO4, následně proběhla inkubace (37 °C, 24 hod). Poté byla provedena dialýza za použití 0,025 um membrány (6 °C, 24 hod). Po proběhnutí sekvenační reakce byly fluorescenčně značené DNA fragmenty byly purifikovány a separovány pomocí CE-LIF (Beckman Coulter).

Výsledky:

V porovnání s kontrolní DNA (bez navázané cisplatiny) byl pozorován výrazný pokles signálu u všech čtyř sledovaných nukleotidů v závislosti na aplikované koncentraci cisplatiny. Tím bylo zjištěno, že cytostatika vázaná do DNA mají stejný vliv na CE-LIF signály všech DNA amplikonů nezávisle na druhu jejich fluorescenčního značení.

Závěr:

S použitím metody Sangerova sekvenování byly sledovány interakce cisplatiny s dsDNA. Ovlivnění cisplatinou je patrné stejnou měrou pro všechny typy fluorescenčně značených amplikonů. Z toho lze usuzovat, že dochází k inhibici sekvenační reakce, pravděpodobně zabráněním DNA polymeráze v polymerační rekaci. Navíc se však podařilo objevit, že některé úseky studované DNA jsou cisplatinou modifikovány více. Na základě těchto výsledků lze usoudit, že metodu Sangerova sekvenování spojenou s CE-LIF analýzou lze použít pro kvantifikaci platinového cytostatika interkalovaného do struktury DNA.

Práce byla finančně podpořena projekty PGS04_2012, NanoBioTECell CACR P102/11/1068.