STUDIUM FUNKCE SESTŘIHOVÝCH VARIANT AKTIVACÍ INDUKOVANÉ DEAMINÁZY U B BUNĚČNÝCH MALIGNIT

Úvod:

 Aktivací indukovaná deamináza (AID) hraje významnou roli při zvyšování efektivity protilátek ve zralých B lymfocytech během imunitní odpovědi. AID vnáší somatické hypermutace (SHM) primárně do imunoglobulinových (Ig) genů a hraje roli také v přesmyku Ig tříd (CSR). Tento enzym má obrovský mutační potenciál - frekvence SHM v Ig je až milionkrát vyšší než frekvence spontánní mutageneze. Studium AID v myších modelech prokázalo souvislost mezi aktivitou AID a množstvím změn v celém genomu (mutace, zlomy, translokace). AID je aberantně exprimovaná u B buněčných malignit i u řady solidních nádorů. U chronické lymfocytární leukemie (CLL), Ph+ akutní lymfoblastické leukemie a lymfomu z plášťových buněk podléhá AID alternativnímu sestřihu. Ve srovnání se zdravými B lymfocyty se zde navíc vyskytují čtyři alternativně sestřižené transkripty AID, které se liší od standardní varianty AID v C terminální doméně.

Cíl:

Tento projekt má za úkol objasnit, zda delece a inzerce v C terminální doméně AID mění její funkční vlastnosti.

Materiál a metody:

Alternativně sestřižené transkripty AID detekované ve vzorku periferní krve CLL pacienta byly naklonovány do retrovirového vektoru. Zralé B lymfocyty purifikované ze slezin AID-/- myší byly stimulovány cytokiny a poté infikovány retroviry exprimující jednotlivé sestřihové varianty AID. Po čtyřdenní kultivaci jsme s pomocí průtokové cytometrie hodnotili CSR. Genomická DNA byla podrobena analýze zlomů a mutací v oblasti přesmyku Ig Sm. Zlomy byly detekovány pomocí ligační PCR a hybridizace s radioaktivně značenou sondou. Mutační analýzu jsme provedli pomocí ultra-hlubokého sekvenování nové generace.

Výsledky:

Zatímco standardní varianta AID indukovala somatické hypermutace, zlomy i přesmyk Ig izotypů, alternativně sestřižené varianty AID se ve všech použitých funkčních testech jevily jako katalyticky neaktivní. CSR, indukce mutací i dvouřetězcových zlomů v Ig Sm byly v buňkách exprimujících alternativně sestřižené AID transkripty pod hranicí detekce použitých esejí.

Závěr:

Výsledky analýzy aktivity sestřihových variant AID v myších stimulovaných B buňkách (AID-/-) poukazují na ztrátu funkce. Role sestřihových variant AID exprimovaných u CLL zůstává nejasná a jejich funkce je třeba dále analyzovat za použití lidských linií odvozených z B buněčných malignit a klinických vzorků.

Výzkum je financován z programu SoMoPro II, který je podpořen EU (REA č. 291782). Výzkum je dále spolufinancován JMK. Tento materiál odráží pouze postoje autora a EU není odpovědná za jakékoli možné použití informací obsažených v takovém materiálu.