Konference: 2005 1. ročník Dny diagnostické, prediktivní a experimentální onkologie
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Postery
Číslo abstraktu: P011
Autoři: P. Hanuštiak; R. Mikelová; Ing. Soňa Křížková, Ph.D.; doc.RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.; prof. RNDr. Petr Hodek, CSc.; prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.; Prof. RNDr. Miroslava Beklová, CSc.; MUDr. Luboš Zeman; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.
Úvod
Jen málokdo by oponoval tvrzení, že látky přijímané v potravě ovlivňují naše zdraví. Průměrný člověk západního typu nemá problémy s nedostatečným příjmem potravy a živin, naopak zkonzumuje běžně více, než je třeba. Je tedy nutné se podrobně dívat i na látky obsažené v potravinách v minoritním množství. Vyloučí-li se z tohoto „množství“ všechny známé esenciální látky jako například vitamíny či minerální prvky, stále nám zbude velká směs sloučenin, které buď pozitivně či negativně ovlivňují zdraví konzumenta. V této souvislosti někteří autoři mluví o potravinách, které se nazývají nutraceutika. Nutraceutika jsou potraviny, které mají pozitivní fyziologické účinky na lidský organismus. Bylo prokázáno, že mají vliv na celkový zdravotní stav člověka a mohou výrazně podporovat fyziologický výkon či snižovat riziko vzniku některých nemocí. Mezi významné látky, které takto efektivně působí, patří rozdílné skupiny metabolitů rostlin, jako fenolové kyseliny, lignany, fytosteroly, karotenoidy, glukosinoláty a mnoho dalších skupin, mezi které náleží i flavonoidy. Flavonoidy jsou velice rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů. V současné době je známo více než 4000 flavonoidních látek a stále se nacházejí nové. Jsou odvozeny od kyslíkaté heterocyklické sloučeniny flavanu, tvořeného dvěma benzenovými kruhy spojenými heterocyklickým pyranem. Běžně bývají všechny tři kruhy substituovány hydroxyskupinami nebo methoxyskupinami, a jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Rozeznáváme následující základní struktury flavonoidů: katechiny, leukoanthokyanidiny, flavanony, flavononoly, flavony, flavonoly a anthokyanidiny. Přírodní flavonoidy se nejčastěji vyskytují ve formě O-glykosidů, obsahují tedy ve své molekule necukernou součást (aglykon) a cukernou složku. Volné aglykony se vyskytují pouze zřídka. V některých případech (při technologickém zpracování při vyšších teplotách a v kyselém prostředí) může docházet k hydrolýze glykosidů a vzrůstu koncentrace aglykonů.
Cíl
V naší práci jsme se zaměřili na vypracování elektroanalytického stanovení quercetinu, quercitrinu, rutinu, diosminu a chrysinu na uhlíkové pastové elektrodě.
Materiály a metody
NaH2PO4, Metanol, Diosmin, Chrysin, uhlíkový prášek a minerální olej byly dodány firmou Sigma Aldrich Corp. (USA). Rutin trihydrat a Quercitrin dihydrat byly dodány firmou Roth GmbH, Karlsruhe (Ger.). Na2HPO4 byla dodaná firmou Merck, Darmstadt (Ger.). Quercetin dihydrat byl dodán firmou Fluka chemie AG (USA). Všechny chemikálie byly ACS čistoty, stejně tak i voda (Sigma), ve které byly připraveny pracovní roztoky.
Elektroanalytické stanovení flavonoidů
Vzorky byly analyzovány na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA- -Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/ 3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Square wave voltametrické (SWV) experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě. Měření bylo prováděno v potenciálovém rozsahu od –0,1 V do 1,2 V s těmito parametry: potenciálový krok 1,95 mV, pulzní amplituda 49,85 mV. Jako základní elektrolyt jsme použili fosfátový pufr o pH = 7,0. Uhlíková pasta (asi 0.5 g) byla vyrobena z uhlíkového prášku a minerálního oleje (bez DNáz, RNáz a proteáz). Poměr uhlíkového prášku a minerálního oleje byl 70/30 (w/w). Pasta byla vložena do teflonového těla elektrody s průměrem plochy elektrody 2,5 mm. Před každým měřením byl povrch elektrody vždy obnoven. Pro úpravu získaných experimentálních dat bylo využito GPES software EcoChemie.
Výsledky
V našich předešlých experimentech bylo zjištěno, že vysoký podíl organické složky zhoršuje elektrochemickou analýzu. Při studiu flavonoidů rozpuštěných v methanolu (96 %) byl však podíl organické fáze v základním elektrolytu (2 ml) jen 0,1 %. Na získaných voltamogramech byly pozorovány čtyři oxidační signály, které byly označeny jako pík 1, pík 2, pík 3 a pík 4. Brettová popisuje signály i) pík 1 a ii) pík 2 jako oxidace hydroxylové skupiny v poloze 7 flavonoidního skeletu. Předpokládáme, že další dva pozorované signály iii) pík 3 a iv) pík 4 odpovídají oxidaci hydroxylové skupiny v poloze 5 flavonoidního skeletu. Navíc byl pozorován vliv cukerné složky flavonoidů na výsledný elektrochemický signál. Pozorovali jsme, že pík 1 quercetinu se obejvil při potenciálu 0,15 V a signály rutinu a quercitrinu při potenciálu 0,25 V. Potenciálový posun o 100 mV může být zapříčiněn přítomností sacharidové skupiny na flavonovém skeletu quercetinu. Elektrochemické signály u chrysinu a diosminu byly výrazně nižší. Pozorovaná elektrochemická odezva bude pravděpodobně souviset s rozdílnou chemickou strukturou studovaných flavonoidů. Nejvyšší vliv na elektrochemické signály byly pozorovatelné u diosminu. I zde lze rozdíl mezi potenciály signálů flavonoidů vysvětlit přítomností disacharidové skupiny u diosminu.
Závěr
Elektrochemická detekce jako možnost stanovení flavonoidů je málo diskutovanou oblastí. Analytické stanovení flavonoidů se v současné době provádí především metodami chromatografickými a kapilární elektroforézou. Ovšem elektrochemické metody mají velkou výhodu v miniaturizaci a umožňují detekci látek in vivo bez usmrcení organismu.
Poděkování. Tato práce byla podpořena granty: GA ČR 525/04/P132, RASO 8/2005, MŠMT 6215712402 a INCHEMBIOL 0021622412.
Literatura
Jen málokdo by oponoval tvrzení, že látky přijímané v potravě ovlivňují naše zdraví. Průměrný člověk západního typu nemá problémy s nedostatečným příjmem potravy a živin, naopak zkonzumuje běžně více, než je třeba. Je tedy nutné se podrobně dívat i na látky obsažené v potravinách v minoritním množství. Vyloučí-li se z tohoto „množství“ všechny známé esenciální látky jako například vitamíny či minerální prvky, stále nám zbude velká směs sloučenin, které buď pozitivně či negativně ovlivňují zdraví konzumenta. V této souvislosti někteří autoři mluví o potravinách, které se nazývají nutraceutika. Nutraceutika jsou potraviny, které mají pozitivní fyziologické účinky na lidský organismus. Bylo prokázáno, že mají vliv na celkový zdravotní stav člověka a mohou výrazně podporovat fyziologický výkon či snižovat riziko vzniku některých nemocí. Mezi významné látky, které takto efektivně působí, patří rozdílné skupiny metabolitů rostlin, jako fenolové kyseliny, lignany, fytosteroly, karotenoidy, glukosinoláty a mnoho dalších skupin, mezi které náleží i flavonoidy. Flavonoidy jsou velice rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů. V současné době je známo více než 4000 flavonoidních látek a stále se nacházejí nové. Jsou odvozeny od kyslíkaté heterocyklické sloučeniny flavanu, tvořeného dvěma benzenovými kruhy spojenými heterocyklickým pyranem. Běžně bývají všechny tři kruhy substituovány hydroxyskupinami nebo methoxyskupinami, a jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Rozeznáváme následující základní struktury flavonoidů: katechiny, leukoanthokyanidiny, flavanony, flavononoly, flavony, flavonoly a anthokyanidiny. Přírodní flavonoidy se nejčastěji vyskytují ve formě O-glykosidů, obsahují tedy ve své molekule necukernou součást (aglykon) a cukernou složku. Volné aglykony se vyskytují pouze zřídka. V některých případech (při technologickém zpracování při vyšších teplotách a v kyselém prostředí) může docházet k hydrolýze glykosidů a vzrůstu koncentrace aglykonů.
Cíl
V naší práci jsme se zaměřili na vypracování elektroanalytického stanovení quercetinu, quercitrinu, rutinu, diosminu a chrysinu na uhlíkové pastové elektrodě.
Materiály a metody
NaH2PO4, Metanol, Diosmin, Chrysin, uhlíkový prášek a minerální olej byly dodány firmou Sigma Aldrich Corp. (USA). Rutin trihydrat a Quercitrin dihydrat byly dodány firmou Roth GmbH, Karlsruhe (Ger.). Na2HPO4 byla dodaná firmou Merck, Darmstadt (Ger.). Quercetin dihydrat byl dodán firmou Fluka chemie AG (USA). Všechny chemikálie byly ACS čistoty, stejně tak i voda (Sigma), ve které byly připraveny pracovní roztoky.
Elektroanalytické stanovení flavonoidů
Vzorky byly analyzovány na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA- -Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/ 3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Square wave voltametrické (SWV) experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě. Měření bylo prováděno v potenciálovém rozsahu od –0,1 V do 1,2 V s těmito parametry: potenciálový krok 1,95 mV, pulzní amplituda 49,85 mV. Jako základní elektrolyt jsme použili fosfátový pufr o pH = 7,0. Uhlíková pasta (asi 0.5 g) byla vyrobena z uhlíkového prášku a minerálního oleje (bez DNáz, RNáz a proteáz). Poměr uhlíkového prášku a minerálního oleje byl 70/30 (w/w). Pasta byla vložena do teflonového těla elektrody s průměrem plochy elektrody 2,5 mm. Před každým měřením byl povrch elektrody vždy obnoven. Pro úpravu získaných experimentálních dat bylo využito GPES software EcoChemie.
Výsledky
V našich předešlých experimentech bylo zjištěno, že vysoký podíl organické složky zhoršuje elektrochemickou analýzu. Při studiu flavonoidů rozpuštěných v methanolu (96 %) byl však podíl organické fáze v základním elektrolytu (2 ml) jen 0,1 %. Na získaných voltamogramech byly pozorovány čtyři oxidační signály, které byly označeny jako pík 1, pík 2, pík 3 a pík 4. Brettová popisuje signály i) pík 1 a ii) pík 2 jako oxidace hydroxylové skupiny v poloze 7 flavonoidního skeletu. Předpokládáme, že další dva pozorované signály iii) pík 3 a iv) pík 4 odpovídají oxidaci hydroxylové skupiny v poloze 5 flavonoidního skeletu. Navíc byl pozorován vliv cukerné složky flavonoidů na výsledný elektrochemický signál. Pozorovali jsme, že pík 1 quercetinu se obejvil při potenciálu 0,15 V a signály rutinu a quercitrinu při potenciálu 0,25 V. Potenciálový posun o 100 mV může být zapříčiněn přítomností sacharidové skupiny na flavonovém skeletu quercetinu. Elektrochemické signály u chrysinu a diosminu byly výrazně nižší. Pozorovaná elektrochemická odezva bude pravděpodobně souviset s rozdílnou chemickou strukturou studovaných flavonoidů. Nejvyšší vliv na elektrochemické signály byly pozorovatelné u diosminu. I zde lze rozdíl mezi potenciály signálů flavonoidů vysvětlit přítomností disacharidové skupiny u diosminu.
Závěr
Elektrochemická detekce jako možnost stanovení flavonoidů je málo diskutovanou oblastí. Analytické stanovení flavonoidů se v současné době provádí především metodami chromatografickými a kapilární elektroforézou. Ovšem elektrochemické metody mají velkou výhodu v miniaturizaci a umožňují detekci látek in vivo bez usmrcení organismu.
Poděkování. Tato práce byla podpořena granty: GA ČR 525/04/P132, RASO 8/2005, MŠMT 6215712402 a INCHEMBIOL 0021622412.
Literatura
- P. Hanuštiak, R. Mikelová, D. Potěšl, P. Hodek, M. Stiborová and R. Kizek Electrochemical behaviour of flavonoids on a surface of a carbon paste electrode, in: J. Ulrichová (Ed.), Toxcon 2005; 10. Interdisciplinary Czech and Slovak Toxicological Conference, Palacký University, Olomouc, Czech Republic, 2005: 44–47.
- P. Hanuštiak, R. Mikelová, D. Potěšil, P. Hodek, M. Stiborová and R. Kizek Determination of flavonoids using of square wave voltammetry, in: J. Blattná, A. Horna and T. Zíma (Eds.), Vitamins 2005 – Targeted Nutritional Therapy, Univerzita Pardubice, Pardubice, Czech Republic, 2005: 175–176.
- P. Hanuštiak, R. Mikelová, A. Kučerová, P. Hodek, M. Stiborová and R. Kizek Analýza flavonoidů pomocí elektrochemických technik, in: J. Žaloudík and R. Vyzula (Eds.), XXIX. Brněnské onkologické dny, Masarykův onkologický ústav v Brně, Brno, Česká republika, 2005: 387–390.
- R. Mikelová, B. Klejdus, P. Hrstková and R. Kizek Chromatografické stanovení isoflavonů ve vegetativních a generativních částech rostlin sóje (glycine max), in: R. Cerkal (Ed.), MendelNET, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, Česká republika, 2003.
- R. Mikelová, B. Klejdus, J. Petrlová, D. Potešil, V. Adam, J. Vacek, R. Kizek and V. Kubáň Application of ultra fast column in HPLC/DAD determination of isoflavones, in: J. Lehotay (Ed.), 12th International symposium advances and applications of chromatography in industry, Slovak University of Technology, Bratislava, Slovenská republika, 2004, pp. CD-ISSN 1335-8413.
- R. Mikelová, B. Klejdus, J. Petrlová, D. Potěšil, V. Adam, M. Stiborová, P. Hodek and R. Kizek Rapid isoflavone determination in soy plants (Glycine max) by high performance liquid chromatography coupled with diode-array detector, in: J. Blattná, A. Horna and T. Zíma (Eds.), Vitamins 2004 Targeted nutritional therapy, Univerzita Pardubice, Pardubice, Česká republika, 2004: P42.
- R. Mikelová, B. Klejdus, J. Zehnálek, J. Vacek, R. Kizek and V. Kubáň Vliv extrakčních postupů na chromatografické stanovení obsahu isoflavonů ve vybraných potravinách vyrobených ze sóji, in: L. Trnková, P. Janderka and R. Kizek (Eds.), IV. Pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků, Masarykova univerzita v Brně, Brno, Česká republika, 2004: 27.
- R. Mikelová, J. Petrlová, B. Klejdus, R. Kizek, J. Zehnálek, V. Adam, J. Vacek, L. Trnková and V. Kubáň Stanovení isoflavonů pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí, in: M. Wimmerová and P. Beneš (Eds.), VIII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Masarykova univerzita v Brně, Brno, Česká republika, 2004: 42.
- R. Mikelová, B. Klejdus, J. Zehnalek, J. Vacek, R. Kizek and V. Kuban Chromatografické stanovení obsahu isoflavonů ve vybraných potravinách ze sóji, in: I. Ingr (Ed.), XXXI. Seminář o jakosti potravin a potravinových surovin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, Česká republika, 2004: 11.
- R. Mikelová, J. Petrlová, P. Babula, V. Adam, L. Trnková, A. Horna and R. Kizek An using of glassy carbon electrode in connection with liquid chromatography for determination of silver, in: P. Jandera (Ed.), 11th International Symposium on Separation Sciences; ISSS 2005, Univerzita Pardubice, Pardubice, Czech Republic, 2005: 204–205.
Datum přednesení příspěvku: 10. 12. 2005
