Studium biologické aktivity naftochinonů

Hospodářsky zcela nevýznamné rostliny, jako je „masožravá“ Dionaea muscipula Ell. (Droseraceae) obsahují celou skupinu naftochinových sloučenin, které mají výrazné antimikrobiální a antiproliferační účinky. V naší studii byla pro studium antimikrobiální a antifungální aktivity rostlinných extraktů zvolena disková difúzní metoda. Byl zjištěn výrazný antibakteriální efekt metanolického a petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. a Nepenthes sp. na Staphyloccocus aureus a výrazný antifungální efekt metanolického i petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. na kvasinku Candida albicans. Rostlinné naftochinony plumbagin, juglon, 3-hyroxy-1,4-naftochinon a lawson byly testovány na cytotoxické vlastnosti na nádorových buněčných liniích K562 (chronická myeloidní leukémie) a MCF7 (karcinom prsu) a prokázaly velmi výrazný cytotoxický efekt srovnatelný s efektem některých komerčně využívaných cytostatik. Proto byly tyto látky testovány na inhibici kináz CDK1/CDK2. Efekt na inhibici těchto kináz byl ovšem s výjimkou plumbaginu málo výrazný.

Klíčová slova: Plumbagin; Juglon; 3-hydroxy-1,4-naftochinon; Dionaea muscipula; protinádorový efekt; antimikrobiální efekt; CDK1/cyklin B; CDK2/cyklin E

1. Úvod
Hledání nových antibakteriálních a cytotoxických látek se v době, kdy prudce narůstá incidence civilizačních chorob, dostává do popředí zájmu mnoha vědních oborů. Mezi nově zkoumané látky patří také naftochinony (juglon, plumbagin a lawson). Některé vystupují jako hlavní obsahové látky hospodářsky zcela nevýznamných rostlin, jako je „masožravá“ Dionaea muscipula Ell. (Droseraceae). Z methanolového extraktu Dionaea muscipula byly b-izolovány deriváty naftochinonů, a to plumbagin, hydroplumbagin 4-O-β-glukopyranosid, 3-hydroxyplumbagin (droseron) a chlorovaný derivát plumbaginu 3-chloroplumbagin [Kreher et. al., 1990]. Další autoři uvádějí výskyt 8,8’-biplumbaginu při in vitro kultivaci Dionaea muscipula [Pakulski and Budzianowski, 1996]. Z čerstvých listů a kořenů byly rovněž získány další dvě látky fenolické povahy, diomuscinon a diomuscipulon, které se z hlediska biogenetického zdají být příbuzné naftochinonu [Myioshi et. al., 1984]. Někteří autoři udávají také izolaci a identifikaci droseronu (3-hydroxyplumbagin) [Kreher et. al., 1990]. Naftochinony se v přírodě vyskytují u celé řady rostlinných čeledí, zejména u čeledí Plumbaginaceae, Juglandaceae, Ebenaceae, Droseraceae, Boraginaceae, Verbenaceae, Balsaminaceae, Bignoniaceae, Ancistrocladaceae, Avicennianaceae, Dioncophyllaceae, Iridaceae, Nepenthaceae, Lythraceae, Gentianaceae, Malvaceae a dalších. Kromě rostlin jsou naftochinony produkovány také houbami, a to zejména rodem Fusarium a také mikroorganismy rodu Streptomyces.

2. Farmakologické vlastnosti naftochinonů
V minulosti byly rostlinné drogy s obsahem naftochinonů používány v tradičních medicínách různých národů; v Číně a jiných asijských zemích byly a jsou využívány při léčbě rakoviny, revmatoidní arthritidy, bolestivé menstruace a zhmožděnin. Jihoameričtí Indiáni používali a stále používají některé rostliny s obsahem naftochinonů k léčbě kožních forem leishmanióz, jiné jsou využívány jako účinné antimalarikum. V Indii se některých rostlin s obsahem naftochinonů využívá jako prostředku proti pohlavním chorobám. V minulosti bylo publikováno pouze málo prací, které by se zabývaly farmakologickým účinkem naftochinonů.
Několik naftochinonů bylo testováno na akutní toxicitu, přičemž byly popsány některé méně i více závažné nežádoucí účinky: průjem, kožní vyrážky, leukocytopenie, zvýšení hladiny fosfatázy v krevním séru a hepatotoxicita [Singh and Udupa, 1997]. Plumbagin a juglon u krys významným způsobem indukují chinon reduktázu (dále QR) a glutathion transferázu (dále GT) v tkáních gastrointestinálního traktu a v ledvinách, přičemž jako silnější induktor se projevil juglon. Účinky v některých typech tkání se projevily již mv malých dávkách (velmi výrazně u ledviny v dávkách 25 µmol/kg/den v případě juglonu i plumbaginu). V indukci QR, v případě GT se jako silnější induktor projevil ve většině případů juglon. V některých tkáních neměl plumbagin sledovaný efekt, zatímco juglon ano (např. tlusté střevo). Efekt nebyl prokázán v tkáních jater, plic, srdce, močového měchýře. Tyto indukované enzymy jsou spjaty s fází II detoxikace karcinogenů, pozitivní efekt v oblasti „ochrany“ tkání byl sledován u krys v případě ně kterých karcinogenů při souč asném podávání plumbaginu a juglonu [Munday and Munday, 2000]. Ně která analoga naftochinonů vystupují jako inhibitory cdc25 fosfatázy A a B. Enzymy zřejmě odpovídají za některé typy nádorového bujení; díky tomu, že jsou inhibovány některými deriváty naftochinonů, ty by mohli být potenciálními terapeutickými zdroji při léčbě některých typů nádorů [Ham et. al., 1998]. V některých studiích byl prokázán antimutagenní efekt naftochinonů [Edenharder and Tang, 1997]. Plumbagin byl testován na antiproliferativní aktivitu in vitro na nádorových buněčných liniích Hep-2 a sarkom S–180, přičemž byly stanoveny také hodnoty glutathionu (GSH), lipidových peroxidů a rovněž byla sledována i inkorporace thymidinu pomocí značeného thyminu označného 3H do nádorových buněk za přítomnosti plumbaginu. Bylo prokázáno zvýšení hla diny lipidových peroxidů za současného snížení GSH a rovněž byla zjištěna signifikantní inhibice inkorporace thyminu do nádorové DNA, což mělo za následek celkovou inhibici biosyntézy DNA.
Při biologickém testování obsahových látek druhu Diospyros maritima Blume (Ebenaceae), byl rovněž jako jeden z naftochinonů testován plumbagin, který projevil velmi silný toxický účinek pro ryby, silný inhibiční účinek na klíčení semen a výrazný účinek antifungální. Tyto efekty byly u plumbaginu nejvýraznější [Higa et. al., 1998]. Ze stonků této rostliny byly izolovány a testovány kromě jiných sloučenin také naftochinony 8’-hydroxyisodiospyrin, isodiospyrin a plumbagin na potenciální cytotoxicitu. Testovaly se čtyři rakovinné buněčné linie, a to HEPA-3B způsobující hepatom, KB způsobující nasofaryngeální karcinom, COLO-25 způsobující karcinom tlustého střeva a HELA způsobující karcinom děložního čípku. Velmi výraznou cytotoxickou aktivitu na linie HEPA-3B, COLO-205 a HELA prokázaly isodiospyrin a plumbagin. Alkannin a shikonin byly spolu s dalšími, i uměle připravenými deriváty naftochinonů, testovány jako možné inhibitory topoisomerázy I [Plyta at. al., 1998]. Plumbagin byl testován u savců v procesech mitózy – bylo zjištěno, že brání procesu rozmotávání DNA – interkaluje se do DNA [Fujii et. al., 1992].
Naftochinony byly testovány i na antimikrobní účinky, některé práce byly zaměřeny na bakterie dutiny ústní. Bylo zjištěno, v porovnání s další testovanou skupinou látek – antrachinony, že nejlepších výsledků bylo dosaženo u plumbaginu, lawsonu a juglonu, při kombinaci dvou naftochinonů docházelo k synergistickému působení a ještě výraznějšímu antimikrobnímu efektu. Nejnižší hodnotu minimální inhibiční koncentrace (MIC) ve studii prokázal plumbagin a kombinace juglon-lawson. Tato studie předpokládá dobrý výhled pro použití těchto látek v boji proti ústním infekcím [Dirdy et. al. 1994]. U nás neregistrovaný léčivý přípravek Mepron® je úspěšně používán jako antiprotozoikum s výrazným účinkem proti Pneumocystis carinii a Plasmodium sp.; obsahovou látkou je atovaquon, derivát 1,4-naftochinonu, analog ubichinonu. Mechanismus účinku na Pneumocystis carinii není zcela objasněn. U druhu Plasmodium je místem účinku naftochinonů cytochrom cb1. Na potenciální antimikrobiální aktivitu byly testovány syntetické 3-hydroxy-2-hydrazino-1,4-naftochinony, odvozené od lapacholu. Toto testování bylo provedeno diskovou difúzní metodou. Test prokázal výrazný antimikrobní účinek na nefermentující gram-negativní bacily (deriváty měly vyšší účinek než lapachol), samotný lapachol prokázal tento efekt i na Klebsiella sp. a Proteus mirabilis, zatímco připravené deriváty tento účinek neměly. Výrazný účinek měly syntetické deriváty na kmeny Staphylococcus aureus 001, 003, 004, ATCC 29.213 a na Staphylococcus epidermidis, zatímco lapachol tento účinek neměl [Oliviera et. al., 2001]. Především syntetické deriváty naftochinonů byly testovány na účinnost proti Trypanozoma cruzi. Jako standard byla použita krystalová violeť. Nejvyšší tripanocidní aktivitu prokázaly některé naftoimidazoly, a to až 34,8 násobně vyšší aktivitu v porovnání se standardem. Monomerní a dimerní synteticky připravené deriváty 1,4-naftochinonu byly testovány in vitro na účinek proti různým stádiím parazitů rodu Leishmania (L. donovani, L. infantum, L. enriettii, L. major), a to na savčích buněčných kulturách pro studium extracellulární leishmanicidní aktivity (promastigoty výše uvedených druhů). Studie ukázala, že antileishmaniální efekt silně závisí na stupni substituce a počtu substituentů skeletu naftochinonů. U monomerních naftochinonů jejich aktivita roste v závislosti na velikosti substituentu na C–2 uhlíku naftochinonového skeletu, u dimerních na stupni substituce a méně také na počtu případných dalších aromatických kruhů. Mechanismus účinku není ještě zcela objasněn, ale naftochinony pravděpodobně zasahují do řetězce přenosu elektronů na mitochondriálních membránách parazitů a způsobují jeho přerušení, čímž dochází kinhibici růstu parazitů a jejich zániku [Boehm et. al., 1981; Kayser et. al., 2000].

3. Materiál a metody

Materiál
Rostliny Dionaea muscipula Ell. pocházely z již zavedených tkáň ových kultur (Ústav přírodních léčiv,Farmaceutické fakulty, Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně FaF VFU Brno), kde byla kultivována na médiu Murasshige Skoog Medium (MS) [Murashige and Skoog, 1962] s přídavkem sacharózy (30 g/l) a aktivního uhlí. Drosera rotundifolia pocházela z explantátových kultur Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně a byla pěstována za stejných podmínek. Nepenthes sp. a Nepenthes cv. Mixta byly získány z Botanické zahrady a arboreta Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně, kde byly kultivovány in vivo volnou kulturou v rašelinovém substrátu. Všechny tyto rostliny s obsahem naftochinonů byly použity na přípravu extraktů pro mikrobiologická testování.
Antibakteriální a antifungální vlastnosti extraktů byly testovány na kulturách Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus CCM 4223 a na Candida albicans GD8186, které pocházely ze sbírky Ústavu mikrobiologie a imunologie VFU Brno. Pro testování cytotoxicity naftochinonů (juglon, plumbagin, 3-hydroxy-1,4-naftochinon, lowson, 1,4-naftochinon, viz. obr.1) byly vybrány buněčné nádorové linie 5K562 (chronická myeloidní leukémie), MCF7 (karcinom prsu), CEM, HL60 a G361 – Laboratoř růstových regulátorů, Univerzita Palackého v Olomouci.

Testování antimikrobiálních a antifungálních vlastností extraktů
Pro ověření antibakteriálních a antifungálních vlastností estraktů byla použita disková difúzní metoda. S. aureus a E. coli byly kultivovány na Mueller-Hiltonově agaru. Disky byly mnapuštěny 100 µl rostlinného extraktu. Mikrobiologický test by vyhodnocen po 24 hodinové kultivaci při 37°C.

Testování cytotoxicity na buněčných liniích
Testované látky byly přidávány k buněčným kulturám (DMEM kultivační médium s přídavkem 10% telecího séra, glutaminu a antibiotik); kultivace probíhala 6 dní v CO2 kultivátoru při 37°C. Životnost buněk byla měřena kalceinovým testem založeným na měření fluorescence (Fluoroskan, Microsystems, Finsko). Zjišťovala se koncentrace usmrcující 50% buněk – IC50.

Inhibiční test cyklin dependentních kináz
Jako substrát pro inhibiční test byly použity CDK1/cyklin B a CDK2/cyklin E (produkované hmyzí buněčnou linií Sf9 koinfikovanou transgenními bakulovirovými vektory). Po skončení kultivace byla fosforylace substrátu kvantifikována intenzitou radioaktivity (radioaktivní značení fosforu) pomocí digitálního analyzátoru BAS 1800 (Fujifilm, Japonsko). Z křivek míry fosforylace peptidového substrátu na koncentraci testované látky byla graficky určena hodnota IC₅₀ vyjadřující koncentraci látky inhibující 50% aktivity enzymu.

4. Výsledky

Hodnocení antimikrobní a antifungální aktivity
Po 24 hodinách kultivace se zvolenými extrakty byly měřeny příslušné inhibiční zóny vzniklé inhibicí růstu nebo usmrcením patogenu. Nejvýraznější inhibiční zóna vznikla za použití petroletherového extraktu z Dionaea muscipula Ell. U ostatních extraktů vznikly jen velmi nevýrazné inhibiční zóny, nebo žádné. Vzniklé inhibiční zóny měly ostré jasné ohraničení. Výrazné inhibiční zóny vznikly u kultivace se Staphylococcus aureus CCM4223. Nejvýraznější antimikrobiální efekt zde prokázaly petrolétherový a methanolický extrakt Dionaea muscipula a petroletherový extrakt Nepenthes sp. Malý efekt zde projevil petroletherový extrakt Drosera rotundifolia a methanolický extrakt Nepenthes sp. Nejvýraznější antifungální efekt na Candida albicans GD 8186 projevil petroletherový extrakt Dionaea muscipula, avšak nebyl pozorován žádný efekt z petroletherových a methanolických extraktů Nepenthes cv. Mixta (obr. 2).

Obr. 1
Chemické struktury studovaných naftochinonů


Cytotoxicita naftochinonů testovaná na buněčných liniích
Pro toto testování bylo vybráno 5 naftochinonů: juglon (5-hydroxy-1,4-naftochinon), plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1,4- naftochinon), 3-hydroxy-1,4-naftochinon, lawson (2-hydroxy-1,4-naftochinon) a 1,4-naftochinon (obr.1). Nejvyšší cytotoxicitu, a to jak na nádorovou linii K562, tak i na MCF7, prokázal jednoznačně plumbagin, nejnižší naopak 3-hydroxy-1,4-naftochinon. Ve vztahu struktury a cytotoxického účinku se ukazuje vliv substituce 1,4-naftochinového skeletu v poloze 5 fenolickou skupinou. Cytotoxicita plumbaginu je velmi výrazná, srovnatelná s některými běžně komerčně používanými cytostatiky (tab. 1).

Tabulka 1
Cytotoxicita a inhibice CDK1 a CDK2 kináz vybranými naftochinony
[ ND – nebylo detekováno, a – cytotoxický efekt, b – cyklin dependentní kinázy]


Obr. 2
Antimikrobiální a antifungální vlastnosti extraktů z rostlin.


Enzymový inhibiční test
Enzymovým inhibičním testem byly studovány na základě prokázané cytotoxické aktivity v předchozím testu naftochinony plumbagin, juglon a 1,4-naftochinon. Nejvýraznější inhibice kináz CDK1/cyklin B a CDK2/cyklin E byla pozorována u plumbaginu (tab.1).

5. Shrnutí a závěr

V našich testech byly naftochinony ve formě extraktů z rostlin, které je obsahují, podrobeny testování na potenciální antimikrobiální a antifungální aktivitu, některé jednotlivě izolované naftochinony pak byly podrobeny testům na potenciální cytotoxicitu a inhibici některých tyrozinkináz. Pro studium antimikrobiální a antifungální aktivity extraktů byla zvolena disková difúzní metoda, jako testované mikroorganizmy byly zvoleny Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus CCM4223 a Candida albicans GD8186. V našich testech byl zjištěn výrazný efekt metanolického a petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. a Nepenthes sp. na Staphyloccocus aureus a výrazný antifungální efekt metanolického i petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. na patogen Candida albicans. Testy prokázaly jen malou citlivost Escherichia coli ktestovaným extraktům. Plumbagin, juglon, 3-hyroxy-1,4-naftochinon a lawson byly testovány na cytotoxické vlastnosti na nádorových buněčných liniích K562 (chronická myeloidní leukémie) a MCF7 (karcinom prsu). Plumbagin, 3-hydroxy-1,4-naftochinon, 1,4-naftochinon a juglon prokázaly velmi výrazný cytotoxický efekt srovnatelný s efektem některých komerčně využívaných cytostatik. Proto byly tyto látky testovány na inhibici kináz CDK1/CDK2. Efekt na inhibici těchto kináz byl ovšem s výjimkou plumbaginu málo výrazný, jejich cytotoxický efekt tedy nebylo možné připsat na vrub pouze inhibici těchto kináz. Některé práce ukazují na schopnost naftochinonů interkalovat do DNA, jiné prokazují inhibici inkorporace thymidinu do DNA nádorových buněk. Tento efekt může být zprostředkován chemickými vlastnostmi naftochinonů spolu s výše popsanými jevy. Co se vztahu struktury a cytotoxického efektu naftochinonů týká, ukazuje se, že důležitou roli zde hraje substituent v poloze 2 naftochinonového skeletu (obr.1).

Literatura

1. BOEHM, P., K. COOPER, A. T. HUDSON, J. P. ELPHICK and N. McHARDY, 1981 In vitro activity of 2-alkyl-3-hydroxy-
   1,4-napthoquinones against Theileria parva. J. Med. Chem. 24: 295-299.
2. DE MOURA, K. C. G., F. S. EMERY, C. NEVES-PINTO, M. DO CARMO, F. R. PINTO et al., 2001 Tripanocidal activity of isolated napthoquinones from Tababuia and some heterocyclic derivates: A rewiev from an interdisciplinary study. J. Braz. Chem. Soc. 12: 325-338.
3. DIRDY, N., L. DUBREUIL and M. PINKAS, 1994 Activity of anthraquinonic and napthoquinonic compounds on oral bacteria. Pharmazie 49: 681-683.
4. EDENHARDER, R., and X. TANG, 1997 Inhibition of the mutagenicity of 2-nitrofluorene, 3-nitrofluoranthene and 1-nitropyrene by flavonoids, coumarins, quinones and other phenolic compounds. Food Chemical Togicology 65: 357-772.
5. ELANGOVAN, V., N. RAMAMOORTHY, S. BALASUBRAMANIAN, N. SEKAR and G. S., 1994 Studies of the antiproliferative effect of some naturally occuring bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma – 180 cell lines. Indian Journal of Pharmacology 26: 266-269.
6. FUJII, N., Y. YAMASHITA, Y. ARIMA, M. NAGASHIMA and H. NAKANO, 1992 Induction of topoisomerase II-mediated DNA claevage by the plant napthoquinones plumbagin and shikonin. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 2589-2594.
7. HAM, S. W., J. PARK, S. LEE, W. KIM, K. KNAG et al., 1998 Naphtoquinone analogs as inactivators of cdc25 phosphatase. Bioorg. Med. Chem. Letter 8: 2507-2510.
8. HIGA, M., K. OGIHARA and S. YOGI, 1998 Bioactive napthoquinone derivates from Diospyros maritima Blume. Chemical Pharmaceutical Bulletin 46: 1189-1193.
9. KAYSER, O., A. F. KIDERLEN, H. LAATSCH and S. L. CROFT, 2000 In vitro leishmanicidal activity of monomeric and dimeric napthoquinones. Acta Tropica 77: 307-314.
   
10. KREHER, B., A. NESZMELYI and H. WAGNER, 1990 Napthoquinones from Dionaea muscipula. Phytochemistry 29: 605-606.
    
11. KUO, Y., C. CHÁNY, S. LI, C. CHOU, C. CHEN et al., 1997 Cytotoxic constituents from the stems of Diospyros maritima. Planta Medica 63: 363-365.
12. MIYOSHI, E., Y. SHIZURI and S. YAMAMURA, 1984 Isolation and structure of diomuscinone and diomuscipulone from Dionaea muscipula. Phytochemistry 23: 2385-2387.
    
13. MUNDAY, R., and C. M. MUNDAY, 2000 Induction of Quinone reductase and glutathione transferase in rat tissuer by juglone and plumbagin. Planta Medica 66: 399-402.
14. MURASHIGE, T., and F. SKOOG, 1962 A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Phys. Plant. 15: 473-497.
15. OLIVEIRA, C. G. T., F. F. MIRANDA, V. F. FERREIRA, C. C. FREITAS, R. F. RABELLO et al., 2001 Synthesis and antimicrobial evaluation of 3-hydrazino-napthoquinones as analogs of lapachol. J. Braz. Chem. Soc. 12: 229-345.
16. PAKULSKI, G., and J. BUDZIANOWSKI, 1996 Ellagic acid derivates and napthoquinones of Dionaea muscipula from in cultures. Phytochemistry 41: 775-778.
17. PLYTA, Z. F., T. LI, V. PAPAGEORGIOU, A. S. MELLIDIS, A. N. ASSIMOPOULOU et al., 1998 Inhibition of topoisomerase I by napthoquinone derivates. Bioorg. Med. Chem. Letter 8: 3385-3395.
18. SINGH, U. V., and N. UDUPA, 1997 Reduced toxicity and enhanced antitumor efficacy of betacyklodextrin plumbagin inclusion komplex in mice bearing Erlich ascites carcinoma. Ind. J. Physiol. Pharmacol. 41: 171-175.

Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, Grantu 525/04/P132 od GA ČR, IGA MZLU 3/2004, Národního centra LN00A081 a FRVŠ 180/2004.