Stanovení thiolových sloučenin a antioxidační aktivity u pacientů s nádory.

Klíčová slova: redukovaný a oxidovaný glutation, antioxidační aktivita, karcinom prostaty

Úvod

Glutation je tripeptid složený z kyseliny glutamové, glycinu a cysteinu. Je obsažen a produkován téměř ve všech eukaryotických buňkách. V buňkách může být ve formě volné molekuly anebo navázaný na protein. Pokud je navázán na proteiny tvoří tzv. glutationolované proteiny (Pastore, et al.). Již po dlouhou dobu je těmto proteinům přisuzována velmi důležitá role při některých patofyziologických procesech, což podporuje několik studií provedených na toto téma. (Cotgreave, et al.), (Klatt, et al.), (Fratelli, et al.). Jedním z nejvýznamnějších S-glutationolovaných proteinů je glutationyl-hemoglobin a to především proto, že se jedná o klinický ukazatel oxidačního stresu v krvi (Bursell, et al.), (Niwa, et al.). Volný glutation se vyskytuje jako redukovaný (GSH) nebo jako oxidovaný (GSSG). GSH se může vlivem nejrůznějších podob oxidačního stresu snadno oxidovat, ale díky činnosti enzymu glutation reduktáza je opět navrácen do své redukované formy. Za normálních podmínek se tento poměr pohybuje kolem 10:1 pro GSH. Ovšem u různých variant oxidačního stresu klesl poměr na hodnotu mezi 10 a 1 (Chai, et al.). Jedním z hlavních mechanismů a funkcí Glutathionu je odstraňování pedoxidu vodíku a volných radikálů pomocí glutation askorbátového cyklu (Pastore, et al.). Sloučeniny produkující oxidační stres (ROS) jsou pro organismus velmi nebezpečné a jejich patogeneze je spojena s onemocněními jako jeou diabetes melitu, ateroskleróza a rakovina (Droge, et al.). S metabolismem GSH je spojen i enzym glutation S transferáza (GST) jež hraje roli detoxifikačního enzymu. Narušení činnosti GST může indikovat rakovinu močového měchýře, kůže a možná i plic (Hayes, et al.).

Oxidační stres představuje porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním reaktivních forem kyslíku. Jedním z ukazatelů porušení této rovnováhy je antioxidační aktivita (Sochor, et al.). Je definována jako schopnost sloučeniny (směsi látek) inhibovat oxidační degradaci různých sloučenin (např. zabraňovat peroxidaci lipidů) (Singh, et al.). Metody jejího stanovení se nejčastěji zakládají na přímé reakci studované látky s radikály (zhášení nebo naopak jejich vychytávání) nebo na reakci s přechodnými kovy (Schlesier, et al.).

Cílem našeho experimentu byla analýza vzorků krevního séra u pacientů trpících diagnostikovaným adenokarcinomem prostaty versus analýza vzorků zdravých jedinců jako kontrolní skupina. Zaměřili jsme se na sledování poměru redukovaného (GSH) a oxidovaného (GSSG) glutationu a na hodnoty antioxidační aktivity.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

Biologické vzorky: K experimentu bylo použito 10 vzorků krevního séra pacientů trpících adenokarcinomem prostaty. Staging tumoru pacientů se pohyboval v rozmezí 1c – 4. Věk pacientů se pohyboval v rozmezí 48–78 let s průměrem 62,7 let. Kontrolní skupinu představovalo 10 zdravých jedinců ve věku 20-26 let, studentů Masarykovy univerzity, z fakulty tělesné výchovy.

Příprava Biologického vzorku pro analýzu poměru GSH/GSSG: Vzorky krevní plazmy byly nejprve zředěny 10% TFA v poměru 1:1. Tím došlo k vysrážení proteinů. Vzorky byl následně 20 s vortexovány a 15 minut centrifugovány při 16400 rpm a 4°C (Eppendorf centrifuge 5417R). Vzniklý supernatant byl odebrán a posléze analyzován pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí.

Analýza thiolových sloučenin: HPLC-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA (ESA Inc., Chelmsford, MA) (pracovní rozsah 0.001-9.999 ml.min-1) a chromatografické kolony s reverzní fází Zorbax eclipse AAA C18 (150 x 4.6; 3,5 µm velikost částic, Agilent Technologies, USA) a CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Vzorek (20 µl) byl injektován automaticky pomocí autosampleru (Model 542, ESA, USA), který má v sobě zabudován i termostatovaný prostor pro kolonu. Vzorky byly během analýzy uchovány v karuselu při teplotě 8°C. Kolona byla termostatována na 32°C. Průtok mobilní fáze byl 1 ml.min^–1. Mobilní fáze se skládala z A: kyseliny trifluorooctové (80 mM) a B: 100% Met-OH. Doba jedné analýzy byla 20 minut.

Analýza antioxidační activity: Pro stanovení antioxidační aktivity a byl použit automatický spektrofotometr BS-400 (Mindray, China), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0.1 °C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1 °C) a optického detektoru. Zdrojem světla je halogeno-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet je promíchán automatickým míchadlem ihned po přidání činidla nebo vzorku o objemu 2-45 µl. Kontaminace je minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Pro detekci bylo možné využít vlnových délek: 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740, 800 nm.

Příslušné množství reagencie (DPPH, ABTS, FRAP, DMPD) bylo inkubováno 15 minut s pevně daným objemem krevního séra a následně byla změřena absorbance této směsi. Pro výpočet antioxidační aktivity byla použita hodnota absorbance samotné reagencie a hodnota absorbance vzorku s reagencií po 15 minutách inkubace, která byla od této hodnoty odečtena. Absorbance byla přepočtena dle kalibrační křivky na ekvivalent kyseliny galové. Postupy měření a příprava reagencií je popsána v protokolu (Sochor, et al.).

Výsledky a diskuse

Celý soubor pacientů měl zvýšenou sérovou hladinu celkového prostatického specifického antigenu (PSA) v době před biopsií se pohybovala v rozmezí 2,3 ng.ml^–1 až 36,5 ng.ml^–1 s průměrem 9,7 ng.ml^–1. Histologicky se u všech pacientů jednalo o acinární adenokarcinom. Pro hodnocení oxidačního stresu bylo použito několik rozdílných metodických přístupů. Byl sledován poměr redukovaného (GSH) a oxidovaného (GSSG) glutationu. Hodnoty byly získány tak, že zjištěná koncentrace GSH zjištěna pomocí HPLC-ED byla podělena zjištěnou koncentrací GSSG. Zjistili jsme hodnoty poměru GSH:GSSG pro skupinu pacientů (n=10) v rozmezí 0,15-7,6 (Obr. 1a) s průměrnou hodnotou poměru 2,7 a relativní směrodatnou odchylkou RSD 86%. Pro kontrolní skupinu byly hodnoty v rozmezí 10,5-21,2 (Obr. 1b) s průměrnou hodnotou 13,69 a RSD 24%. Z grafů je jasně patrné, že všichni pacienti trpí oproti kontrolní skupině zvýšeným oxidačním stresem. Tyto hodnoty mohou ukazovat na vážnější zdravotní potíže, však také mohou ukazovat funkčnost protinádorových léčiv, které produkují větší množství volných kyslíkových radikálů, které ničí nádorovou masu.



Obrázek 1.: Hodnoty poměru redukovaného a oxidovaného glutationu u pacientů (a) a u kontrolní skupiny (b).

Antioxidační aktivita u pacientů byla stanovena čtyřmi principielně odlišnými metodami. Pomocí DPPH testu, který je založen na schopnosti stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-1 pikrylhydrazylu reagovat s donory vodíku. Pomocí ABTS metody, u které se neutralizuje radikál ABTS (2,2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonátu). Metodou FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), jež je založena na redukci železitých komplexů TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazin) s chloridem železitým. A pomocí sloučeniny DMPD (N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzen), která se v experimentálním roztoku převede, pomocí působení železité soli, na relativně stabilní a barevnou radikálovou formu. Výsledky testů byly vyjádřeny ekvivalentem kyseliny galové (GAE), což je standardní látka, na kterou byly vztaženy hodnoty antioxidační aktivity. Díky tomuto přepočtu můžeme mezi sebou hodnoty pacientů a kontrolní skupiny, ale také jednotlivé metody, porovnat. Každá z metod stanovení antioxidační aktivity, které jsme v našem experimentu použili, vychytává/zháší jinou skupinu volných radikálů (Apak, et al.). Je proto žádoucí stanovit ji více metodami současně, výsledky jsou pak komplexnější a lépe reprezentovatelné.



Tabulka 2.: Hodnoty antioxidační aktivity u kontrolní skupiny.

V naší studii byly u skupiny pacientů s adenokarcinomem prostaty zaznamenány výrazně nižší hodnoty antioxidační aktivity než u skupiny kontrolní. Tato skutečnost poukazuje na vyšší oxidační stres, což potvrdily i výsledky poměru oxidovaného a redukovaného glutationu. Naše výsledky se shodují se závěry exaktních studií, zaměřující se na výzkum karcinomu prostaty, které prokázaly, že u onkologicky nemocných pacientů dochází k transformaci antioxidačních obranných systémů (Yilmaz, et al.). Především pak také dochází ke změně indexu peroxidace lipidů (Aydin, et al.), enzymu superoxiddismutásy a katalásy (Baker, et al.), které jsou jedny z nejdůležitějších obranných systémů v těle. Důsledkem těchto změn následně dochází k celkovému snížení antioxidační aktivity (Pace, et al.).

Závěr

Hodnocení antioxidačního statusu by se mohlo stát důležitým ukazatelem oblasti léčení onkologických onemocnění. Výsledky v naší studii potvrdily poměr redukovaného a oxidovaného glutationu jako ukazatel oxidačního stresu u pacientů s karcinomem prostaty.

Literatura:

1. Pastore, A., et al., (2001): Determination of blood total, reduced, and oxidized glutathione in pediatric subjects, Clinical Chemistry, 47: 1467-1469.
2. Cotgreave, I. A., et al., (1998): Recent trends in glutathione biochemistry – Glutathione-protein interactions: A molecular link between oxidative stress and cell proliferation?, Biochemical and Biophysical Research Communications, 242: 1-9.
3. Klatt, P., et al., (2000): Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress, European Journal of Biochemistry, 267: 4928-4944.
4. Fratelli, M., et al., (2002): Identification by redox proteomics of glutathionylated proteins in oxidatively stressed human T lymphocytes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99: 3505-3510.
5. Bursell, S. E., et al., (2000): The potential use of glutathionyl hemoglobin as a clinical marker of oxidative stress, Clinical Chemistry, 46: 145-146.
6. Niwa, T., et al., (2000): Increased glutathionyl hemoglobin in diabetes mellitus and hyperlipidemia demonstrated by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry, Clinical Chemistry, 46: 82-88.
7. Chai, Y. C., et al., (1994): S-THIOLATION OF INDIVIDUAL HUMAN NEUTROPHIL PROTEINS INCLUDING ACTIN BY STIMULATION OF THE RESPIRATORY BURST – EVIDENCE AGAINST A ROLE FOR GLUTATHIONE DISULFIDE, Archives of Biochemistry and Biophysics, 310: 273-281.
8. Droge, W., et al., (1986): Glutathione augments the activation of cytotoxic lymphocytes-t invivo, Immunobiology, 172: 151-156.
9. Hayes, J. D., et al., (1999): Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a Co-ordinately regulated defence against oxidative stress, Free Radical Research, 31: 273-300.
10. Sochor, J., et al., (2010): An assay for spectrometric determination of antioxidant activity of a biological extract, Listy Cukrovarnicke a Reparske, 126: 416-417.
11. Singh, S., et al., (2008): In vitro methods of assay of antioxidants: An overview, Food Reviews International, 24: 392-415.
12. Schlesier, K., et al., (2002): Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods, Free Radical Research, 36:177-187.
13. Sochor, J., et al., (2010): Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages, Molecules, 15: 8618-8641.
14. Yilmaz, M. I., et al., (2004): Antioxidant system activation in prostate cancer, Biological Trace Element Research, 98: 13-19.
15. Aydin, A., et al., (2006): Oxidative stress and antioxidant status in non-metastatic prostate cancer and benign prostatic hyperplasia, Clinical Biochemistry, 39: 176-179.
16. Baker, A. M., et al., (1997): Expression of antioxidant enzymes in human prostatic adenocarcinoma, Prostate, 32: 229-233.
17. Pace, G., et al., (2010): Oxidative Stress in Benign Prostatic Hyperplasia and Prostate Cancer, Urologia Internationalis, 85:328-333.
18. Apak, R., et al., (2007): Comparative evaluation of various total antioxidant capacity assays applied to phenolic compounds with the CUPRAC assay, Molecules, 12: 1496-1547.

Poděkování: Příspěvek vznikl za podpory grantů GAČR 301/09/P436 a CYTORES GA ČR P301/10/0356, Liga proti rakovině Praha 2011.