Konference: 2011 XXXV. Brněnské onkologické dny a XXV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Genitourinární nádory
Téma: Postery
Číslo abstraktu: 233p
Autoři: Mgr. Markéta Vaculovičová (Ryvolová), Ph.D.; Ing. Soňa Křížková, Ph.D.; Ing. Jiří Sochor, Ph.D.; Mgr. Natalia Vladimirovna Cernei; Mgr. Ondřej Zítka; MUDr. Jaromír Gumulec; Mgr. Marián Hlavna; prof. Ing. Ivo Provazník; doc., RNDr. Michal Masařík, Ph.D.; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.
*) Korespondenční autor: kizek@sci.muni.cz
Klíčová slova: sarkosin, karcinom prostaty, diagnostika, biomarker, moč
Úvod
Zhoubné nádory prostaty (CaP) jsou v současnosti druhé nejčastější nádorové onemocnění u mužů (Abrhamova, Anonymous, Anonym). V roce 2004 bylo v Evropské Unii v mužské populaci diagnostikováno 1 534 700 nových případů nádorového onemocnění. Z toho bylo 237 800 nových případů CaP (15.5%), což jej po karcinomu plic řadí k druhému nejčastějšímu nádorovému onemocnění v mužské populaci. Z histologického hlediska se jedná především o adenokarcinomy (> 90%), zbývajících asi 10% jsou malobuněčné, skvamózní a karcinomy z přechodných buněk (Cavalli). CaP vykazují malý metastatický potenciál, obvykle jsou asymptomatické a rostou pomalu, z tohoto důvodu jsou často zjištěny až při autopsii (Giles). Část pacientů však trpí agresivními formami CaP, které naopak mají vysoký sklon k metastatování a objevují se v nižším věku a jsou příčinou jejich úmrtí. Především pro tyto pacienty je mimořádně důležitá včasná diagnostika a odlišení formy CaP. V současnosti je pro diagnostiku CaP používána kombinace stanovení PSA (prostata-specifický antigen) v krevním séru, digitální rektální vyšetření a biopsie (Ellis, et al., Gerber, et al.). Ačkoli je PSA doposud jediným biomarkerem pro CaP, ukazuje se, že není zcela spolehlivým ukazatelem přítomnosti CaP (Humbert, et al.), a především při screeningových aplikacích může vést jak k falešně pozitivním tak k falešně negativním výsledkům a tím k zanedbání nádorového onemocnění nebo naopak ke zbytečným indikacím biopsie. Z tohoto důvodu jsou intenzivně hledány nové biomarkery CaP. K nejperspektivnějším molekulám patří PCA3, EPCA a genové fúze, především u genových rodin TRMPSS2 a ETS (Goo, et al., Stephan, et al.). Pro screeningové účely jsou hledány biomarkery CaP také v moči. V současné době je známo více než 30 potenciálních molekul použitelných jako markery CaP v moči, k nejslibnějším patří AMACR (alpha-methyl coenzym A racemasa), PCA1 (prostatový antigen 1), PCA3 (prostatový antigen 3), 8-OhdG (8hydroxydeoxyguanosin), MMP9 (matrixová metalloproteinasa 9) a sarkosin (Jamaspishvili, et al.). V roce 2009 byla provedena proteomická a metabolomická studie, kdy bylo v moči pacientů s CaP analyzováno 583 molekul. Bylo zjištěno, že v moči 80% pacientů s agresivní formou CaP byla zvýšená hladina nekódující aminokyseliny sarkosinu (N-methylglycin) a tato aminokyselina zároveň nebyla přítomna v moči kontrolních jedinců. Bylo také zjištěno, že obsah sarkosinu je zvýšený v buněčných kulturách CaP ve srovnání s benigními buňkami. Benigní prostatické buňky navíc po přídavku sarkosinu vykazovaly zvýšenou motilitu a invazivitu (Sreekumar, et al.).
Cílem této práce bylo navržení techniky vhodné pro stanovení sarkosinu v biologických vzorcích, především v moči a buněčném lyzátu a použití této techniky pro studium obsahu sarkosinu v moči a prostatických nádorových buněčných liniích.
Experimentální část
Materiál a metody
Pro analýzu sarkosinu byl použit kapalinový chromatograf AAA 400 (Ingos, Česká republika). Eluce probíhala skokovým gradientem čtyř pufrů se zvyšujícím se pH a iontovou silou, dále byl zapojen i zvyšující se gradient teploty. Objem nástřikové smyčky byl 100 µl při přesnosti nástřiku RSD 1%. Dvoukanálový VIS detektor s objemem průtočné kyvety 5 µl pracoval při vlnových délkách 440 a 570 nm.
K analýzám pomocí CE byl použit přístroj PACE 5500 (Beckman, Česká rep.). Měření probíhalo v kapiláře s vnitřním průměrem 50 µm a délkou 57 cm (50 cm k detektoru) při použití napětí 20 kV. Jako separační elektrolyt byl použit 50 mM CuSO4 v 0,05% kyselině octové. Detekce je založena na měření absorbance komplexů Cu2+ iontů s molekulami poskytujícími volný elektronový pár při 254 nm.
Obr. 1
Průměrná hladina sarkosinu v moči pacientů s adenokarcinomem prostaty a kontrol. Výsledky byly testovány na hladině významnosti p < 0.05 (t-test).
Pro stanovení proteinů, glukosy, močoviny, kyseliny močové a kreatininu byl použit automatický spektrofotometr BS–400 (Mindray, China). Pro stanovení analytů byly použity kity od firmy Greiner (Německo) a pro stanovení močoviny kit od firmy A. L. Instruments (Maďarsko). Do plastových kyvet bylo dle návodu pipetováno 200 µl reagencie a následně bylo přidáno 20 µl měřeného vzorku. Absorbance byla měřena po 10 min při vlnových délkách: λ = 570 nm (bílkoviny), 505 nm (glukosa), 578 nm (močovina), 546 nm (kyselina močová), a 505 nm (kreatinin). Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 10 minutové inkubaci se vzorkem. Hodnoty byly od sebe odečteny a výsledek přepočítán dle kalibrační křivky.
Koncentrace iontů K+, Na+ a Cl– byla stanovena pomocí nepřímé potenciometrie za použití iontově selektivních elektrod, které jsou součástí přístroje BS-400.
Prostatické buňky 22Rv1 byly kultivovány v RPMI-1640 mediu s 10% FBS a suplementací penicilinem a streptomycinen (1U/ml). Po synchronizaci růstu pasážováním byly buňky ovlivněny přídavkem 0; 50; 150 a 300 µM ZnSO4 po dobu 72 h. Vzorky moči pacientů s nádorovým onemocněním byly získány z Urologického oddělení FN U svaté Anny v Brně. Kontrolní vzorky byly získány od dobrovolníků – studentů VŠ.
Výsledky a diskuse
Kapilární elektroforéza, jako vysoce účinná separační metoda, byla optimalizována pro analýzu obsahu sarkosinu v nádorových prostatických buňkách. Bylo zjištěno, že buňky karcinomu prostaty 22Rv1 produkují sarkosin a že tato aminokyselina má vliv na fenotyp benigních prostatických buněk. Zároveň je známo, že vlastnosti těchto buněk jsou významně ovlivněny koncentrací zinku. Z tohoto důvodu byl obsah sarkosinu sledován v nádorových a kontrolních buněčných kulturách ovlivněných zinkem (0; 50; 150 a 300 µM ZnSO4). Bylo zjištěno, že zatímco u kontrolních linií byl obsah sarkosinu konstantní, u nádorových buněk klesal se zvyšující se koncentrací ZnSO4. Tyto výsledky jsou konzistentní s předchozími poznatky a naznačují, že jak sarkosin tak Zn mají vliv na fenotyp 22Rv1 buněk.
Po optimalizaci a validaci ionexové chromatografie bylo testováno použití této metody pro stanovení sarkosinu v biologických vzorcích. Výsledky stanovení sarkosinu v moči pacientů (n = 11) a zdravých dobrovolníků (n = 25) jsou ukázány na grafu v obr. 1. Z grafu je patrné, že zatímco v moči dobrovolníků byl průměrný obsah sarkosinu 0.1 ± 0,3 µmol sarkosinu/mmol kreatininu, u pacientů s CaP byl průměrný obsah sarkosinu 4.7 ± 0.7 µmol sarkosinu/mmol kreatininu. Tyto výsledky naznačují, že sarkosin je potenciálně vhodný marker pro diagnostiku karcinomu prostaty.
Závěr
Naše výsledky ukazují, že obsah průměrný obsah sarkosinu ve vzorcích moči pacientů s karcinomem prostaty je 47x vyšší než v kontrolních vzorcích. Stanovení sarkosinu ve spojení se stanovením ostatních biomarkerů CaP tedy má potenciál pro zlepšení diagnostiky karcinomu prostaty a vyloučení falešně pozitivních a falešně negativních případů.
Literatura:
Klíčová slova: sarkosin, karcinom prostaty, diagnostika, biomarker, moč
Úvod
Zhoubné nádory prostaty (CaP) jsou v současnosti druhé nejčastější nádorové onemocnění u mužů (Abrhamova, Anonymous, Anonym). V roce 2004 bylo v Evropské Unii v mužské populaci diagnostikováno 1 534 700 nových případů nádorového onemocnění. Z toho bylo 237 800 nových případů CaP (15.5%), což jej po karcinomu plic řadí k druhému nejčastějšímu nádorovému onemocnění v mužské populaci. Z histologického hlediska se jedná především o adenokarcinomy (> 90%), zbývajících asi 10% jsou malobuněčné, skvamózní a karcinomy z přechodných buněk (Cavalli). CaP vykazují malý metastatický potenciál, obvykle jsou asymptomatické a rostou pomalu, z tohoto důvodu jsou často zjištěny až při autopsii (Giles). Část pacientů však trpí agresivními formami CaP, které naopak mají vysoký sklon k metastatování a objevují se v nižším věku a jsou příčinou jejich úmrtí. Především pro tyto pacienty je mimořádně důležitá včasná diagnostika a odlišení formy CaP. V současnosti je pro diagnostiku CaP používána kombinace stanovení PSA (prostata-specifický antigen) v krevním séru, digitální rektální vyšetření a biopsie (Ellis, et al., Gerber, et al.). Ačkoli je PSA doposud jediným biomarkerem pro CaP, ukazuje se, že není zcela spolehlivým ukazatelem přítomnosti CaP (Humbert, et al.), a především při screeningových aplikacích může vést jak k falešně pozitivním tak k falešně negativním výsledkům a tím k zanedbání nádorového onemocnění nebo naopak ke zbytečným indikacím biopsie. Z tohoto důvodu jsou intenzivně hledány nové biomarkery CaP. K nejperspektivnějším molekulám patří PCA3, EPCA a genové fúze, především u genových rodin TRMPSS2 a ETS (Goo, et al., Stephan, et al.). Pro screeningové účely jsou hledány biomarkery CaP také v moči. V současné době je známo více než 30 potenciálních molekul použitelných jako markery CaP v moči, k nejslibnějším patří AMACR (alpha-methyl coenzym A racemasa), PCA1 (prostatový antigen 1), PCA3 (prostatový antigen 3), 8-OhdG (8hydroxydeoxyguanosin), MMP9 (matrixová metalloproteinasa 9) a sarkosin (Jamaspishvili, et al.). V roce 2009 byla provedena proteomická a metabolomická studie, kdy bylo v moči pacientů s CaP analyzováno 583 molekul. Bylo zjištěno, že v moči 80% pacientů s agresivní formou CaP byla zvýšená hladina nekódující aminokyseliny sarkosinu (N-methylglycin) a tato aminokyselina zároveň nebyla přítomna v moči kontrolních jedinců. Bylo také zjištěno, že obsah sarkosinu je zvýšený v buněčných kulturách CaP ve srovnání s benigními buňkami. Benigní prostatické buňky navíc po přídavku sarkosinu vykazovaly zvýšenou motilitu a invazivitu (Sreekumar, et al.).
Cílem této práce bylo navržení techniky vhodné pro stanovení sarkosinu v biologických vzorcích, především v moči a buněčném lyzátu a použití této techniky pro studium obsahu sarkosinu v moči a prostatických nádorových buněčných liniích.
Experimentální část
Materiál a metody
Pro analýzu sarkosinu byl použit kapalinový chromatograf AAA 400 (Ingos, Česká republika). Eluce probíhala skokovým gradientem čtyř pufrů se zvyšujícím se pH a iontovou silou, dále byl zapojen i zvyšující se gradient teploty. Objem nástřikové smyčky byl 100 µl při přesnosti nástřiku RSD 1%. Dvoukanálový VIS detektor s objemem průtočné kyvety 5 µl pracoval při vlnových délkách 440 a 570 nm.
K analýzám pomocí CE byl použit přístroj PACE 5500 (Beckman, Česká rep.). Měření probíhalo v kapiláře s vnitřním průměrem 50 µm a délkou 57 cm (50 cm k detektoru) při použití napětí 20 kV. Jako separační elektrolyt byl použit 50 mM CuSO4 v 0,05% kyselině octové. Detekce je založena na měření absorbance komplexů Cu2+ iontů s molekulami poskytujícími volný elektronový pár při 254 nm.
Obr. 1
Průměrná hladina sarkosinu v moči pacientů s adenokarcinomem prostaty a kontrol. Výsledky byly testovány na hladině významnosti p < 0.05 (t-test).
Pro stanovení proteinů, glukosy, močoviny, kyseliny močové a kreatininu byl použit automatický spektrofotometr BS–400 (Mindray, China). Pro stanovení analytů byly použity kity od firmy Greiner (Německo) a pro stanovení močoviny kit od firmy A. L. Instruments (Maďarsko). Do plastových kyvet bylo dle návodu pipetováno 200 µl reagencie a následně bylo přidáno 20 µl měřeného vzorku. Absorbance byla měřena po 10 min při vlnových délkách: λ = 570 nm (bílkoviny), 505 nm (glukosa), 578 nm (močovina), 546 nm (kyselina močová), a 505 nm (kreatinin). Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 10 minutové inkubaci se vzorkem. Hodnoty byly od sebe odečteny a výsledek přepočítán dle kalibrační křivky.
Koncentrace iontů K+, Na+ a Cl– byla stanovena pomocí nepřímé potenciometrie za použití iontově selektivních elektrod, které jsou součástí přístroje BS-400.
Prostatické buňky 22Rv1 byly kultivovány v RPMI-1640 mediu s 10% FBS a suplementací penicilinem a streptomycinen (1U/ml). Po synchronizaci růstu pasážováním byly buňky ovlivněny přídavkem 0; 50; 150 a 300 µM ZnSO4 po dobu 72 h. Vzorky moči pacientů s nádorovým onemocněním byly získány z Urologického oddělení FN U svaté Anny v Brně. Kontrolní vzorky byly získány od dobrovolníků – studentů VŠ.
Výsledky a diskuse
Kapilární elektroforéza, jako vysoce účinná separační metoda, byla optimalizována pro analýzu obsahu sarkosinu v nádorových prostatických buňkách. Bylo zjištěno, že buňky karcinomu prostaty 22Rv1 produkují sarkosin a že tato aminokyselina má vliv na fenotyp benigních prostatických buněk. Zároveň je známo, že vlastnosti těchto buněk jsou významně ovlivněny koncentrací zinku. Z tohoto důvodu byl obsah sarkosinu sledován v nádorových a kontrolních buněčných kulturách ovlivněných zinkem (0; 50; 150 a 300 µM ZnSO4). Bylo zjištěno, že zatímco u kontrolních linií byl obsah sarkosinu konstantní, u nádorových buněk klesal se zvyšující se koncentrací ZnSO4. Tyto výsledky jsou konzistentní s předchozími poznatky a naznačují, že jak sarkosin tak Zn mají vliv na fenotyp 22Rv1 buněk.
Po optimalizaci a validaci ionexové chromatografie bylo testováno použití této metody pro stanovení sarkosinu v biologických vzorcích. Výsledky stanovení sarkosinu v moči pacientů (n = 11) a zdravých dobrovolníků (n = 25) jsou ukázány na grafu v obr. 1. Z grafu je patrné, že zatímco v moči dobrovolníků byl průměrný obsah sarkosinu 0.1 ± 0,3 µmol sarkosinu/mmol kreatininu, u pacientů s CaP byl průměrný obsah sarkosinu 4.7 ± 0.7 µmol sarkosinu/mmol kreatininu. Tyto výsledky naznačují, že sarkosin je potenciálně vhodný marker pro diagnostiku karcinomu prostaty.
Závěr
Naše výsledky ukazují, že obsah průměrný obsah sarkosinu ve vzorcích moči pacientů s karcinomem prostaty je 47x vyšší než v kontrolních vzorcích. Stanovení sarkosinu ve spojení se stanovením ostatních biomarkerů CaP tedy má potenciál pro zlepšení diagnostiky karcinomu prostaty a vyloučení falešně pozitivních a falešně negativních případů.
Literatura:
- Abrhamova, J., (2005): www.uzis.cz/cz/nor/norindx.htm, Národní onkologický registr
- Anonymous, (2008): The global burden of disease: 2004
update
- Anonym, (2009): Neoplasms 2006/Cancer incidence 2006
- Cavalli, F., (2009): Textbook of medical oncology
- Giles, G., (2010): The Epidemiology of Prostate Cancer
- Ellis, W. J., et al., (1994): Diagnosis of prostatic carcinoma: the yield of serum prostate specific antigen, digital rectal examination and transrectal ultrasonography, J Urol, 152: 1520-5.
- Gerber, G. S., et al., (1991): Routine screening for cancer of the prostate, J Natl Cancer Inst, 83: 329-35.
- Humbert, L., et al., (2010): Somatic Molecular Genetics of Prostate Cancer
- Goo, Y. A., et al., (2010): Advances in proteomic prostate cancer biomarker discovery, Journal of Proteomics, 73: 1839-1850.
- Stephan, C., et al., (2009): New Markers and Multivariate Models for Prostate Cancer Detection, Anticancer Research, 29: 2589-2600.
- Jamaspishvili, T., et al., (2010): Urine markers in monitoring for prostate cancer, Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 13: 12-19.
- Sreekumar, A., et al., (2009): Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression, Nature, 457: 910-914.
Datum přednesení příspěvku: 5. 5. 2011
