Stanovení povrchové kontaminace zdravotnických zařízení cytotoxickými léčivy

Úvod

Profesní expozice cytotoxickým léčivům je v současnosti vnímána jako negativní aspekt poskytování zdravotní péče onkologickým pacientům. Mezi hlavní nebezpečné vlastnosti CL patří genotoxicita, karcinogenita, vývojová a reprodukční toxicita. S ohledem na současné poznatky o distribuci kontaminace na onkologických pracovištích lze za hlavní z jmenovaných expozičnich cest označit příjem dermální (1). Toto tvrzení vychází z četných zpráv o výskytu různých cytostatik na povrchu běžného vybavení pracovišť zajišťujících přípravu i aplikaci těchto léčiv pacientům. Právě na sledování tohoto typu kontaminace je uváděná metoda zaměřena.

Tento příspěvek popisuje metodiku pro stanovení povrchové kontaminace pracovního prostředí cyklofosfamidem, 5-fluorouracilem a platinovými komplexy. Použitelnost popisovaného postupu je dokumentována na příkladech výsledků testů na výtěžnost a opakovatelnost metody.

Materiál a metody

Materiál

K odběru vzorku se používají kompresní obklady z netkané textilie (Mesoft, 7.5 cm x 7.5 cm). Pro stanovení platiny se používá 1% HC1 (p.a.) v MilliQ vodě. Extrakční roztok a současně vodná složka mobilní fáze pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (20 mM acetátový pufr, pH = 4) je připravován za použití MilliQ vody (min. 17 MQ * cm), kys. octové a octanu amonného (oba gradient grade). Organickou složkou mobilní fáze je acetonitril (gradient grade).

Odběr a příprava vzorku

Stěr se odebírá nejčastěji z plochy 30 x 30 cm pomocí stěrky navlhčené 0,75 ml 20 mM acetátového pufru. Použitá stěrka se pak extrahuje na ultrazvukové lázni v acetátovém pufru přidaném ke vzorku do konečného objemu 25 ml (doba extrakce = 30 minut). Extrakt (1 ml) je na závěr zcentrifugován 10 minut při 20 tis. G.

Stanovení cyklofosfamidu

Pro stanovení cyklofosfamidu v připraveném extraktu se používá kapalinový chromatograf (Agilent HP 1200 HPLC System) v tandemu s hmotnostním detektorem (Agilent 6410 TripleGuad). K separaci je využívána kolona ZORBAX SB-18 (2.1 x 30 mm, 3.5 \xm). Hmotnostní detekce je založena na sledování přechodu 261 -» 140 (m/z).

Stanovení 5-fluorouracilu

Stanovení 5-fluorouracilu probíhá na kapalinovém chromatografu s UV detektorem (Agilent HP1200 HPLC System) a kolonou Supelco ABZplus (4.6 mm x 250 mm, 5 \xm). Pro kvantifikaci analytu využíváme záznamu absorbance při 266 nm.

Stanovení platiny

Stanovení platinových komplexů se zakládá na kvantifikaci celkového množství platiny ve vzorku metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (Agilent ICP-MS System 7500ce). Připravené extrakty se před samotnou analýzou ředí 1% HC1 v poměru 1:14. K detekci se využívá sledování nuklidů Pt 194 a 195.

Ověření metody

Ověření použitelnosti metody bylo provedeno opakovaným zpracováním kontrolních vzorků se známým množství analytu. Krátkodobá opakovatelnost vystihuje shodnost metody v rámci jedné analytické série (provedené v jednom dni) a byla stanovena paralelním zpracováním tří vzorků od každé koncentrace. Dlouhodobá opakovatelnost odpovídá shodnosti metody mezi jednotlivými sériemi analýz a její hodnota byla odvozena od výsledků tří sérií analýz provedených vždy s odstupem jednoho týdne. Ostatními prezentovanými parametry metody jsou výtěžnost metody a účinnost vzorkování. Stanovení výtěžnosti metody (zpracování vzorku) se zakládá na hodnocení dat získaných během předešlých měření. Účinnost vzorkování byla ověřena zpracováním tří vzorků získaných vzorkováním kontrolních ploch s přesně definovanou kontaminací (2). Použitelnost metody pro stanovení léčiv s obsahem platiny byla ověřována na příkladu Cisplatiny, jejíž spotřeba je v Masarykově onkologickém ústavu z uvedené skupiny léčiv nejvyšší.

Výsledky a diskuze

Velmi dobrou výtěžnost i opakovatelnost metody jsem zaznamenali v případě cyklofosfamidu a 5-fluorouracilu. Výtěžnost metody se pro tato dvě léčiva pohybuje v rozmezí 90 - 117% s krajními hodnotami zjištěnými v nejnižších koncentracích (tabulka č. 1 a 2). Relativní směrodatné odchylky (RSD) krátkodobé i dlouhodobé opakovatelnosti se u těchto léčiv pohybují do 12%. Také zde byla pozorována mírná tendence růstu rozptylu hodnot s klesající koncentrační úrovní. Ve spodní oblasti koncentračního rozsahu je proto třeba počítat s menší přesností i správností metody.

Kriterium pro vyhovující hodnoty výtěžnosti a opakovatelnosti metody bylo splněno i v případě Cisplatiny (tabulka č.3). Ačkoli jsou výsledky u tohoto analytu méně uspokojivé (výtěžnost 50-60%, opakovatelnost do 25%), s ohledem na náš záměr zavést metodu pro paralelní stanovení všech tří vybraných léčiv hodnotíme oba výsledky kladně. Na základě výsledků testů na výtěžnost celé metody v porovnání se samotným zpracováním vzorků vyplývá, že celková výtěžnost není limitována účinností stírání, ale spíš používaným extrakčním roztokem, který je primárně uzpůsoben pro extrakci cyklofosfamidu a 5-fluorouracilu.

Z pohledu limitů detekce lze za velmi citlivé označit stanovení cyklofosfamidu metodou HPLC - tandem MS a platiny metodou ICP-MS. Detekční limit pro cyklofosfamid byl stanoven na 2,5 ng/stěr. U platiny leží limit použité metody dokonce ještě 10-lOOx níž, ovšem z praktického hlediska nelze v rámci hodnocení kontaminace platinovými cytostatiky uznávat za pozitivní výsledky nižší než obdobnou hodnotu 2,5 ng/stěr. Nižší hodnoty již nelze spolehlivě odlišit od běžných pozadových koncentrací platiny v prostředí. Nejméně citlivá metoda je HPLC-UV, která se využívá ke stanovení 5-fluorouracilu (detekční limit = 750 ng/stěr). Bohužel při použití HPLC-MS není dosahováno lepších výsledků. Na vině je malá hmotnost molekuly, která je snadno zaměnitelná s molekulami jiných látek přítomných v matrici vzorku.

Závěr

Cíl zavést metodu pro paralelní hodnocení tří nejvíce užívaných cytotoxických léčiv byl splněn. Ve vztahu ke známým hodnotám současné kontaminace onkologických oddělení, je zavedená metoda dostatečně citlivá (3). Výhodou této metody jsou malé nároky na materiál a čas potřebný ke zpracování vzorků. Limitujícím faktorem je však technické vybavení laboratoře, jeho kapacita a náklady na jeho provoz. Dle současných zkušeností lze zajeden měsíc reálně analyzovat přibližně 100 vzorků.

Literatura

1. Kromhout, H., Hoek, R, Uitterhoeve, R., Huijbers, R., Overmars, R. R, Anzion, R., Vermeulen, R. (2000): Postulating a dermal pathway for exposure to anti-neoplastic drugs among hospital workers. Ann Occup Hyg 44(7): 551-560.
   
2. Occupational Safety & Health Administration: Method Evaluation Guidelines for Surface Sampling Methods, Salt Lake Technical Center, USA. (http://www.osha.gov/dts/sltc/methods/surfacesampling/surfacesampling.html)
   
3. Kiffmeyer T. et al. (2008): Monitoring-Effect Study of Wipe Sampling in Pharmacies. At: International Colloquium: Antineoplastic Drug Monitoring, 30-Apr-2008, Hennef, Germany. (http://www.pharma-monitor.de/objectfiles/3080/Kiffmeyer_Germany_Int_Colloquium_Hennef_30.04.2008.pdf)

Poděkování

Výzkum je podporován projektem CYTO 2B06171 s podporou Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR.