Srovnání molekulárně diagnostických metod pro detekci polymorfismů v genu TPMT

Enzym thiopurin-S-methyltransferaza (TPMT) je zodpovědný za metabolismus thiopurinových léčiv. Thiopurinová léčiva jsou nasazována u pacientů, u nichž je cílem potlačit imunitu (transplantace, revmatická artritida, Crohnova choroba, lupus atd.). V genu pro enzym TPMT se přibližně u 10 % europoidní populace vyskytují jednonukleotidové polymorfismy, které snižují funkčnost enzymu. Thiopuriny u těchto pacientů nejsou úplně metabolizovány, což mívá za následek závažné vedlejší účinky, které mohou vést až k selháni léčby. V současné době není zavedena rutinní genotypizace pacientů uživajících thiopurinová léčiva. Je to dáno i faktem, že na trhu není dostupná dostatečně jednoduchá, rychlá a levná metoda pro analýzu těchto polymorfismů.

Společnost YB UX s.r.o. ve spolupráci s Laboratoři farmakogenetiky VFU Brno vyvinula diagnostickou soupravu na principu polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR). Pomocí tohoto kitu lze identifikovat tři nejfrekventovanější polymorfismy v genu TPMT (238G C, 460G A, 719A G). Součásti produktu jsou i syntetické plasmidové konstrukty, které slouží jako pozitivní kontrola pro wild-type i mutantní alelu.

Cílem této práce bylo srovnat vyšetření mutací v genu TPMT pomocí detekční soupravy vyvinuté společností YB UX se dvěma konkurenčními produkty. První srovnávaná metoda je také založena na real-time PCR, druhá pak využívá princip hybridizace produktů amplifikace na testovací proužky obsahující alelově specifické oligonukleotidové sondy imobilizované do rovnoběžných linií. Při porovnávání byla stanovena tato kritéria: úspěšnost záchytu polymorfismů, úspěšnost PCR, citlivost reakce, uživatelská vstřícnost postupu analýzy, doba trvání analýzy. Srovnání metod bylo provedeno na 40 vzorcích DNA . Vstupní koncentrace DNA se pohybovala od 0,1 μl/ml do 5 μl/ml.

Porovnání výsledků prokázalo, že diagnostická souprava vyvinutá společností YB UX je pro stanovení polymorfismů v genu TPMT z uživatelského pohledu optimální. Kit je schopen zachytit mutace i ve vzorku s nejnižší koncentrací DNA . Faktor lidské chyby je minimalizován, protože příprava reakce obnáší pouze přidání vzorku DNA nebo standardu k hotové reakční směsi. Další srovnávané metody vyžadovaly delší dobu přípravy reakce, výrazně vyšší počet kroků pracovního postupu a vykazovaly nižší citlivost detekce.

Podpořeno grantem MPO č. FR-TI2/075.