Somatické mutace v Ki-ras genu detekované v bioptických vzorcích tlustého střeva

Úvod
Česká republika je známa vysokým výskytem kolorektálních karcinomů. Incidence těchto malignit v posledních pěti letech dosáhla 81-84 případů na 100 000 mužů a 56-60 případů na 100 000 žen (1). Rozvoj sporadického kolorektálního adenokarcinomu je na molekulární úrovni spojován s genetickými změnami v DNA střevních buněk. Somatické mutace v Ki-ras genu (lokalizace 12p12.1) patří mezi klíčové události objevující se přibližně uprostřed předpokládané neoplastické kaskády, která probíhá v tlustém střevě. V našich předchozích pracích založených na studiu resekovaných karcinomů byla frekvence Ki-ras mutací odhadnuta na 38% (34% mutací v kodonu 12 a 4% mutací v kodonu 13) (2,3). V této navazující studii bylo naším cílem: a) vyšetřit pří tomnost mutací v Kiras genu v bioptických vzorcích kolorektálních tumorů a polypů, b) identifikovat typ nalezených mutací a c) porovnat výskyt mutací mezi benigními a maligními střevními tumory

Materiál a metody
Celkem bylo vyšetřeno 50 bioptických vzorků hyperplastických polypů, adenomatosních polypů a kolorektálních karcinomů odebraných koloskopicky od 28 mužů a 22 žen s mediánem věku 69 roků (rozsah 19-86 roků). Kontrolní soubor tvořilo 11 bioptických vzorků morfologicky normální střevní sliznice pocházející od 6 mužů a 5 žen s mediánem věku 57 roků (rozsah 42-71 roků). Všechny vzorky byly získány při standardním endoskopickém a následném histologickém vyšetření, s informovaným souhlasem pacientů. Pro molekulárně biologické vyšetření Ki-ras genu byla použita dvoustupň ová PCR a detekce přítomnosti mutace pomocí RFLP analýzy (štěpení MvaI restrikčním enzymem v kodonu 12 a BglI enzymem v kodonu 13 genu). Identifikace mutací byla provedena DNA sekvenováním PCR produktů (ABI PRISM 310, Applied Biosystems – Dr. Klánová a Dr. Bastlová, Masarykova universita Brno).

Výsledky
Ki-ras mutace byly nalezeny v 8 z 18 (44%) vyšetřovaných karcinomů a v 8 z 19 (42%) adenomatosních polypů. Mutace nebyly detekovány ani ve vzorcích hyperplastických polypů ani v normální střevní tkáni. Sekvenování ukázalo, že nejběžnější genetickou změnou, která zasahuje kodon 12 genu, je transverze GGT-GTT. Tento typ mutace byl identifikován v 50% karcinomů a 71% adenomů s prokázanou přítomností mutace. V kodonu 13 byla identifikována tranzice GGC-GAC pouze v jednom kolorektálním adenomu. Detailnější informace o mutacích, včetně klinické a histopatologické klasifikace positivně testovaných tumorů a polypů demonstruje Tabulka 1.



Diskuse
PCR produkt byl úspěšně amplifikován ve všech vyšetřených DNA vzorcích, což dokazuje, že bioptické vzorky střevní sliznice jsou vhodným biologickým materiálem pro detekci bodových mutací v Ki-ras genu. Naše výsledky ukazují, že incidence mutací v karcinomech a velkých adenomatosních polypech je přibližně stejná.
V souladu s již dříve publikovanými závěry (4) je mutace GGT-GTT v kodonu 12 Ki-ras genu nejfrekventovanější genetickou změnou objevující se v střevních buň kách v souvislosti s kolorektálními adenokarcinomy a adenomatosními polypy.
Několik studií provedených v minulosti poukázalo na vzájemný vztah mezi některými typy mutací v Ki-ras genu a agresivitou kolorektálních karcinomů, nicméně teprve multicentrická studie Andreyeva a kol. jednoznačně definovala transversi G T jako jedinou signifikantní genetickou změnu v tomto genu podporující nádorovou progresi (5). Z tohoto pohledu a navzdory nízké diagnostické sensitivitě se detailní molekulárně biologická analýza Ki-ras genu v bioptických vzorcích střevní tkáně zdá být vhod nou metodou pro zlepšení laboratorní diagnostiky kolorektálního karcinomu, především u pacientů pocházejících z rizikových skupin.

Literatura

1. 
   
2. Zdravotnická ročenka České republiky, ÚZIS ČR, 1998-2002.
   
3. Beránek M., Bureš J., Palička V., Jandík P., Langr F., Nejedlá E.: A relationship between K-ras gene mutations ans some clinical and histologic variables in patients with primary colorectal carcinoma. Clin Chem Lab Med, 37, 1999, 723-7.
   
4. Beránek M., Jandík P., Bureš J., Rejchrt S., Dědič K., Palička V. Výskyt bodových mutací v 13. kodonu K-ras genu u kolorektálních tumorů. Klin Biochem Metab, 10, 2002, 146-50.
   
5. Span, M., Moerkerk, T.M., De Goeij, A.F.P.M., Arends, J.W. A detailed analysis of K-ras point mutations in relation to tumor progression and survival in colorectal cancer patients. Int J Cancer, 69, 1996, 241-5.
   
6. Andreyev H.J.N., Norman, A.R., Cunningham, D., Oates, J., Dix, B.R., Iacopetta, B.J., et al. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the RASCAL II study. Brit J Cancer, 85, 2001, 692-6.