Konference: 2006 14. onkologicko-urologické sympozium a 10. mammologické sympozium
Kategorie: Genitourinární nádory
Téma: Nádory ledvin - operační léčba
Číslo abstraktu: 020
Autoři: MUDr. Šárka Lukešová, Ph.D.; doc. MUDr. Otakar Kopecký, CSc.; Mgr. Vladimíra Vroblová, Ph.D.; PharmDr. Doris Vokurková, Ph.D.; MUDr. Petr Morávek, CSc.; MUDr. Hynek Šafránek; RNDr. Pavel Souček, CSc.
CÍL
Stanovit fenotyp TIL (tumor infiltrujících buněk) získaných od nemocných s renálním karcinomem (RCC) a provést srovnání s fenotypem periferních krevních lymfocytů (PBL) izolovaných z v.renalis a v.cubitalis.
MATERIÁL A METODA
Vzorky periferní krve z cubitální a renální žíly a buňky nádorového stromatu byly získány od 44 pacientů v průběhu operace pro primární RCC. Soubor byl tvořen 15 ženami a 29 muži ve věkovém rozmezí od 31 do 82 roků, věkový průměr byl 65,9 let. Většině pacientů byla provedena radikální nefrektomie (42 pacientů), ve dvou případech byla provedena resekce části ledviny. Bilaterální nález tumoru ledviny byl nalezen u jednoho pacienta, kterému byla provedena jednostranná nefrektomie a enkapsulace tumoru na druhé postižené ledvině. Podle histologických nálezů se v 86 % (36 pacientů) jednalo o konvenční světlobuněčný arcinom, v 9 % (4 případy) šlo o papilární karcinom, ve 5 % (2 pacienti) byl nalezen chromofóbní karcinom. Jednou byl diagnostikován sarkomatoidní karcinom, který vznikl transformací chromofobního karcinomu a jednou neklasifikovatelný karcinom vycházející pravděpodobně z Henleovy kličky (»loopom«). TIL byly izolovány z mechanicky desintegrované nádorové tkáně. PBL a TIL byly inkubovány s monoklonálními protilátkami, aby byly definovány jejich povrchové a aktivační znaky na průtokovém cytometru.
VÝSLEDKY
Hlavní populací TIL byly T-lymfocyty CD3+ (69,7%). Počet CD3+/ CD8+ T lymfocytů byl signifikantně vyšší v TIL, 42,6% (p < 0,01), zatímco CD4+ T lymfocyty byly většinovou populací v periferní krvi, 41,35% (p < 0,001). Zastoupení CD3+/69+ T lymfocytů bylo signifikantně vyšší v TIL, 32.9%, než v PBL (p < 0,001). Naopak, počty CD3+/CD25+, CD8+/57+ a CD4+/RA+ (naivní CD4+ T lymfocyty) byly vyšší v PBL (p < 0,001). Rozdíly v zastoupení NK buněk (CD 3-/ 16+56+) a CD3+/DR+ T buněk v TIL a PBL nebyly signifikantní.
DISKUSE
Za protinádorovou odpověď jsou zodpovědny tumor infiltrující lymfocyty (TIL). Imunofenotyp TIL je rozdílný od PBL. Jedná se o heterogenní populaci cytotoxických buněk nesoucích převážně fenotyp CD3+ /CD8+ a CD3-/CD16+/CD56+. CD4+ T lymfocyty a B lymfocyty jsou minoritní populací v TIL.
Až u 70% renálních tumorů tvoří CD8+ T lymfocyty hlavní buněčnou populaci TIL buněk, jejich zastoupení v TIL je signifikantně vyšší oproti nálezům v periferní krvi. S tímto nálezem souhlasí i naše pozorování.
Zastoupení NK buněk v TIL nebylo u našich nemocných signifikantně zvýšeno. NK buňky jsou považovány za hlavní efektorovou buněčnou populaci v protinádorové odpovědi. CD 56 molekula je prezentována téměř na všech NK buňkách, zatímco CD 57 molekula je prezentována jen na zralých NK buňkách. Nízký počet NK buněk mezi TIL je spojen s vyšším rizikem progrese nádoru. Chybění CD3-CD56+CD16+ buněk v periferní krvi a/nebo mezi TIL buňkami u nemocných s renálním karcinomem je spojeno s vyšším rizikem rozvoje metastáz.
Protinádorovou aktivitu vykazují CD4+ T lymfocyty, které jsou hlavním producentem IL-2. Působením IL-2 je indukována diferenciace a aktivace cytotoxických T lymfocytů a NK buněk. Th1 subset CD4+ T lymfocytů produkuje IFN γ a zesiluje cytotoxickou funkci CD8+ T lymfocytů. Naopak, převažuje-li aktivita Th2 subsetu je upřednostňována protilátková odpověď a prostřednictvím IL4 a IL5 je potlačována funkce Th1 podtypu.
Specifické T lymfocyty se po setkání s antigenem aktivují, což je provázeno změnou exprese mnohých molekul, jako například HLA-DR a receptoru pro IL-2 (CD 25), molekuly CD 69. Molekula CD 25 odráží časné stadium buněčné aktivace a je prezentována na větším počtu T lymfocytů infiltrujících tumor oproti T lymfocytům v periferní krvi. Zvýšená exprese CD 25 (řetězce α , který je součástí receptoru pro IL-2), na T lymfocytech u renálního karcinomu je považována za průkaz lokální protinádorové aktivity.
Vyjádření HLA-DR molekul je projevem prolongované stimulace. Molekuly HLA-DR II.třídy je možné prokázat na buňkách se zpožděním 48–72 hodin po antigenní stimulace. Výsledky naší studie se shodují s jinými pracemi, popisujícími expresi molekul HLA-DR na CD3 a CD8 pozitivních T lymfocytech. Ačkoliv zastoupení CD3+/ DR+ a CD8+/DR+ buněk bylo u našich pacientů vyšší v TIL než PBL, nebyly tyto rozdíly signifikantní.
Přítomnost aktivovaných T lymfocytů nemusí odrážet protinádorovou odpověď. Zvýšená exprese aktivačních znaků CD69, HLA DR a nízká denzita CD25 na T lymfocytech je pozorována i u jiných chorob vyvolaných nebo provázených imunopatologickou reaktivitou, například u zánětlivých chorob pojiva. Je pravděpodobné, že je u části nemocných infiltrace nádoru aktivovanými lymfocyty způsobena nespecificky cytokinovým a chemokinovým mikroprostředím nádoru. Stimulace nádorovými antigeny může být u většiny případů nedostatečná nebo může zcela chybět. Rostoucí nádorová tkáň je vystavena ischemii a pokud není dostatečné cévní zásobení, propadá nekróze. Do nekrotické tkáně vcestují fagocytující buňky, které produkují chemoatraktanty a prozánětové cytokiny. Endoteliální buňky novotvořených cév produkují řadu faktorů stimulujících též proliferaci CD4+T lymfocytů. Th2 lymfocyty produkují IL-13, který má proangiogenní efekt. Nespecifická stimulace může být ve svém důsledku odpovědna za selhání imunologického dozoru.
B lymfocyty tvoří minoritní populaci TIL. Ačkoliv přesná role B lym- focytů není známa, vyjádření molekuly CD69 na B lymfocytech infiltrujících tumor svědčí o jejich účasti v protinádorové odpovědi. V případě nádoru může protilátková odpověď na nádorové antigeny vést po navázání Ig k zablokování epitopů rozpoznávaných specifickými cytotoxickými T lymfocyty a potencovat nádorový růst. Vyšší zastoupení B lymfocytů mezi TIL bylo pozorováno u nemocných s převahou aktivity CD4+ infiltrujících T lymfocytů respektive Th2 populace. Význam role antigen prezentující buňky nebyl v případě B lymfocytů u nádorových onemocnění jednoznačně prokázán. U našich nemocných tvořily B lymfocyty méně než 1% TIL a jejich počty byly v porovnání s počty v PBL signifikantně nižší.
ZÁVĚR
Lze shrnout, že imunokompetentní buňky jsou u renálního karcinomu aktivovány. Avšak transformace těchto imunokompetentních buněk v efektorové cytotoxické T lymfocyty a NK buňky je potlačována zatím neznámými, nejspíše multifaktoriálními mechanismy.
Nelze vyloučit, že u většiny nemocných převažuje nespecifická stimulace TIL. Aktivace Th2 lymfocytů, charakterizovaná tvorbou IL-4 a IL-5, nebo aktivita regulačního subsetu Tr (Th3), produkující TGF β a IL-10, může být jedním z příčin selhání lokální buněčné specifické protinádorové odpovědi. Je tak omezena žádoucí protektivní aktivita subsetu Th1 (s tvorbou IFN γ ), který je důležitý pro cytotoxickou aktivitu vůči nádoru. Působením Th2 lymfocytů je imunitní odpověď nachýlena k protilátkové odpovědi a k tvorbě cytokinů, které mohou stimulovat růst nádoru, např. IL13 svým angiogenním působením. IL-10 potlačuje expanzi cytotoxických CD3+/CD8+ T lymfocytů.
Cytokinové prostředí nádoru a angiogenní faktory a nedostačující nádorové antigenní podněty jsou patrně zodpovědné za neúčelnou zánětovou lokální reakci a progresi tumoru. Ve většině případů k prolomení tohoto stavu, při kterém jsou tolerovány nádorové struktury, nevedou ani imunomodulační zásahy interleukinem -2 a interferonem α.
Tento příspěvek vznikl s podporou grantu výzkumného záměru IGA: NR/8914-4 a MZO 00179906.
Stanovit fenotyp TIL (tumor infiltrujících buněk) získaných od nemocných s renálním karcinomem (RCC) a provést srovnání s fenotypem periferních krevních lymfocytů (PBL) izolovaných z v.renalis a v.cubitalis.
MATERIÁL A METODA
Vzorky periferní krve z cubitální a renální žíly a buňky nádorového stromatu byly získány od 44 pacientů v průběhu operace pro primární RCC. Soubor byl tvořen 15 ženami a 29 muži ve věkovém rozmezí od 31 do 82 roků, věkový průměr byl 65,9 let. Většině pacientů byla provedena radikální nefrektomie (42 pacientů), ve dvou případech byla provedena resekce části ledviny. Bilaterální nález tumoru ledviny byl nalezen u jednoho pacienta, kterému byla provedena jednostranná nefrektomie a enkapsulace tumoru na druhé postižené ledvině. Podle histologických nálezů se v 86 % (36 pacientů) jednalo o konvenční světlobuněčný arcinom, v 9 % (4 případy) šlo o papilární karcinom, ve 5 % (2 pacienti) byl nalezen chromofóbní karcinom. Jednou byl diagnostikován sarkomatoidní karcinom, který vznikl transformací chromofobního karcinomu a jednou neklasifikovatelný karcinom vycházející pravděpodobně z Henleovy kličky (»loopom«). TIL byly izolovány z mechanicky desintegrované nádorové tkáně. PBL a TIL byly inkubovány s monoklonálními protilátkami, aby byly definovány jejich povrchové a aktivační znaky na průtokovém cytometru.
VÝSLEDKY
Hlavní populací TIL byly T-lymfocyty CD3+ (69,7%). Počet CD3+/ CD8+ T lymfocytů byl signifikantně vyšší v TIL, 42,6% (p < 0,01), zatímco CD4+ T lymfocyty byly většinovou populací v periferní krvi, 41,35% (p < 0,001). Zastoupení CD3+/69+ T lymfocytů bylo signifikantně vyšší v TIL, 32.9%, než v PBL (p < 0,001). Naopak, počty CD3+/CD25+, CD8+/57+ a CD4+/RA+ (naivní CD4+ T lymfocyty) byly vyšší v PBL (p < 0,001). Rozdíly v zastoupení NK buněk (CD 3-/ 16+56+) a CD3+/DR+ T buněk v TIL a PBL nebyly signifikantní.
DISKUSE
Za protinádorovou odpověď jsou zodpovědny tumor infiltrující lymfocyty (TIL). Imunofenotyp TIL je rozdílný od PBL. Jedná se o heterogenní populaci cytotoxických buněk nesoucích převážně fenotyp CD3+ /CD8+ a CD3-/CD16+/CD56+. CD4+ T lymfocyty a B lymfocyty jsou minoritní populací v TIL.
Až u 70% renálních tumorů tvoří CD8+ T lymfocyty hlavní buněčnou populaci TIL buněk, jejich zastoupení v TIL je signifikantně vyšší oproti nálezům v periferní krvi. S tímto nálezem souhlasí i naše pozorování.
Zastoupení NK buněk v TIL nebylo u našich nemocných signifikantně zvýšeno. NK buňky jsou považovány za hlavní efektorovou buněčnou populaci v protinádorové odpovědi. CD 56 molekula je prezentována téměř na všech NK buňkách, zatímco CD 57 molekula je prezentována jen na zralých NK buňkách. Nízký počet NK buněk mezi TIL je spojen s vyšším rizikem progrese nádoru. Chybění CD3-CD56+CD16+ buněk v periferní krvi a/nebo mezi TIL buňkami u nemocných s renálním karcinomem je spojeno s vyšším rizikem rozvoje metastáz.
Protinádorovou aktivitu vykazují CD4+ T lymfocyty, které jsou hlavním producentem IL-2. Působením IL-2 je indukována diferenciace a aktivace cytotoxických T lymfocytů a NK buněk. Th1 subset CD4+ T lymfocytů produkuje IFN γ a zesiluje cytotoxickou funkci CD8+ T lymfocytů. Naopak, převažuje-li aktivita Th2 subsetu je upřednostňována protilátková odpověď a prostřednictvím IL4 a IL5 je potlačována funkce Th1 podtypu.
Specifické T lymfocyty se po setkání s antigenem aktivují, což je provázeno změnou exprese mnohých molekul, jako například HLA-DR a receptoru pro IL-2 (CD 25), molekuly CD 69. Molekula CD 25 odráží časné stadium buněčné aktivace a je prezentována na větším počtu T lymfocytů infiltrujících tumor oproti T lymfocytům v periferní krvi. Zvýšená exprese CD 25 (řetězce α , který je součástí receptoru pro IL-2), na T lymfocytech u renálního karcinomu je považována za průkaz lokální protinádorové aktivity.
Vyjádření HLA-DR molekul je projevem prolongované stimulace. Molekuly HLA-DR II.třídy je možné prokázat na buňkách se zpožděním 48–72 hodin po antigenní stimulace. Výsledky naší studie se shodují s jinými pracemi, popisujícími expresi molekul HLA-DR na CD3 a CD8 pozitivních T lymfocytech. Ačkoliv zastoupení CD3+/ DR+ a CD8+/DR+ buněk bylo u našich pacientů vyšší v TIL než PBL, nebyly tyto rozdíly signifikantní.
Přítomnost aktivovaných T lymfocytů nemusí odrážet protinádorovou odpověď. Zvýšená exprese aktivačních znaků CD69, HLA DR a nízká denzita CD25 na T lymfocytech je pozorována i u jiných chorob vyvolaných nebo provázených imunopatologickou reaktivitou, například u zánětlivých chorob pojiva. Je pravděpodobné, že je u části nemocných infiltrace nádoru aktivovanými lymfocyty způsobena nespecificky cytokinovým a chemokinovým mikroprostředím nádoru. Stimulace nádorovými antigeny může být u většiny případů nedostatečná nebo může zcela chybět. Rostoucí nádorová tkáň je vystavena ischemii a pokud není dostatečné cévní zásobení, propadá nekróze. Do nekrotické tkáně vcestují fagocytující buňky, které produkují chemoatraktanty a prozánětové cytokiny. Endoteliální buňky novotvořených cév produkují řadu faktorů stimulujících též proliferaci CD4+T lymfocytů. Th2 lymfocyty produkují IL-13, který má proangiogenní efekt. Nespecifická stimulace může být ve svém důsledku odpovědna za selhání imunologického dozoru.
B lymfocyty tvoří minoritní populaci TIL. Ačkoliv přesná role B lym- focytů není známa, vyjádření molekuly CD69 na B lymfocytech infiltrujících tumor svědčí o jejich účasti v protinádorové odpovědi. V případě nádoru může protilátková odpověď na nádorové antigeny vést po navázání Ig k zablokování epitopů rozpoznávaných specifickými cytotoxickými T lymfocyty a potencovat nádorový růst. Vyšší zastoupení B lymfocytů mezi TIL bylo pozorováno u nemocných s převahou aktivity CD4+ infiltrujících T lymfocytů respektive Th2 populace. Význam role antigen prezentující buňky nebyl v případě B lymfocytů u nádorových onemocnění jednoznačně prokázán. U našich nemocných tvořily B lymfocyty méně než 1% TIL a jejich počty byly v porovnání s počty v PBL signifikantně nižší.
ZÁVĚR
Lze shrnout, že imunokompetentní buňky jsou u renálního karcinomu aktivovány. Avšak transformace těchto imunokompetentních buněk v efektorové cytotoxické T lymfocyty a NK buňky je potlačována zatím neznámými, nejspíše multifaktoriálními mechanismy.
Nelze vyloučit, že u většiny nemocných převažuje nespecifická stimulace TIL. Aktivace Th2 lymfocytů, charakterizovaná tvorbou IL-4 a IL-5, nebo aktivita regulačního subsetu Tr (Th3), produkující TGF β a IL-10, může být jedním z příčin selhání lokální buněčné specifické protinádorové odpovědi. Je tak omezena žádoucí protektivní aktivita subsetu Th1 (s tvorbou IFN γ ), který je důležitý pro cytotoxickou aktivitu vůči nádoru. Působením Th2 lymfocytů je imunitní odpověď nachýlena k protilátkové odpovědi a k tvorbě cytokinů, které mohou stimulovat růst nádoru, např. IL13 svým angiogenním působením. IL-10 potlačuje expanzi cytotoxických CD3+/CD8+ T lymfocytů.
Cytokinové prostředí nádoru a angiogenní faktory a nedostačující nádorové antigenní podněty jsou patrně zodpovědné za neúčelnou zánětovou lokální reakci a progresi tumoru. Ve většině případů k prolomení tohoto stavu, při kterém jsou tolerovány nádorové struktury, nevedou ani imunomodulační zásahy interleukinem -2 a interferonem α.
Tento příspěvek vznikl s podporou grantu výzkumného záměru IGA: NR/8914-4 a MZO 00179906.
Datum přednesení příspěvku: 29. 11. 2006
