SESTŘIHOVÉ VARIANTY U PACIENTŮ S LYNCHOVÝM SYNDROMEM

Východiska:

Zárodečné mutace v genech MLH1, MSH2, MSH6 jsou příčinou Lynchova syndromu. Významnou část těchto mutací tvoří mutace ovlivňující sestřih mRNA. Nejčastěji dochází k deleci jednoho nebo více exonů z mRNA (exon skipping) nebo k aktivaci kryptického místa sestřihu. Na úrovni DNA se jedná převážně o sekvenční změny v místech sestřihu na rozhraní intron/ exon a přilehlých oblastech. Správný sestřih mohou narušit i substituce (missense, silent) nacházející se uvnitř exonu, a to tak, že dojde k narušení ESEs míst (exonic splicing enhancers) nebo vytvoření ESSs míst (exonic splicing silencers).

Metody:

Při určování vlivu nalezené varianty na sestřih postupujeme následovně: 1) Lokalizace varianty – nachází se ve 100% konzervovaném místě sestřihu, nebo mimo něj? 2) Predikce pomocí počítačových programů jako např. BDGP Splice Site Prediction by Neural Network, GeneSplicer, NNSPLICE, MaxEnt. 3) Je varianta popsaná v literatuře/ mezinárodní databázi? 4) Byla provedena analýza mRNA? 5) Umožňuje použitá metodika mRNA analýzy inhibici NMD? 6) Jsou dostupné segregační studie?

Výsledky:

Ve vyšetřovaném souboru 380 pacientů byly nalezeny 4 sestřihové mutace, které se nacházejí ve 100% konzervovaném donorovém nebo akceptorovém místě sestřihu. Tři mutace narušující sestřih se nacházejí na terminálních koncích exonů. Všechny již byly popsány v literatuře a byla u nich provedena mRNA analýza – 2 substituce v genu MLH1 mají za následek deleci celého exonu z mRNA, 1 substituce v genu MSH2 způsobí částečný exon skipping. Ve spolupráci s FDN byla provedena analýza mRNA u 3 nově detekovaných variant nejasného významu, u kterých byla predikována pravděpodobnost aberantního sestřihu. Aberantní sestřih byl prokázán u varianty MLH1/ c.1990– 3C>G, kdy dochází k deleci celého exonu z mRNA sekvence. U druhých 2 variant (duplikace 24 bází zasahující až do pozice IVS9– 8 a delece 2 bází v pozici IVS7– 4_IVS7_5del) v intronech genu MSH6 byl vliv na sestřih vyloučen a zároveň byla prokázána přítomnost transkriptu obou alel na základě přítomnosti polymorfizmů. Při mRNA analýze je nutné brát v úvahu poměrně častý jev – NMD (nonsense mediated mRNA decay), kdy je přednostně degradován transkript z mutované alely, který způsobuje předčasnou terminaci translace.

Závěr:

Vhodným nástrojem při určování vlivu dané varianty na sestřih jsou predikční programy. Nezastupitelnou roli má však analýza mRNA, která potvrdí nebo vyloučí vliv na sestřih in vitro.

Testování bylo podpořeno grantem MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805) a MSMT CR CZ.1.07/ 2.3.00/ 20.0045 (SuPReMMe).