SELDI TOF hmotnostní spektrometrie v onkologickém výzkumu: analýza souboru melanomů, germinálních nádorů a kardiotoxicity u pacientek s her2 pozitivním karcinomem prsu.

Souhrn

Komplex bílkovin živých organismů- proteom -lze studovat řadou analytických technik [1-5]. Hlavními technikami studia proteomu jsou dvourozměrná elektroforéza [6] a hmotnostní spektrometrie [7]. Hmotnostní spektrometrie (MS- Mass spectrometry) je fyzikálně chemická technika k určování hmotnosti atomů, molekul a jejich částí po převedení do plynné fáze ve formě kladných nebo záporných iontů. Velmi rozšířenou variantou hmotnostní spektrometrie v proteomickém výzkumu je kombinace laserové ionizace s hmotnostním analyzátorem TOF. Kvarterní a terciární struktury proteinů je třeba před analýzou SELDI TOF rozrušit a proteiny linearizovat, případně rozpustit komplexy nebo agregáty přítomné buď fyziologicky nebo indukované analytickými podmínkami. V chromatografických a elektroforetických metodách se pro denaturaci terciárních a kvarterních struktur bílkovin na struktury sekundární používá nasycený roztok močoviny nebo guanidinu [8]. Pro analýzu technikami hmotnostní spektrometrie lze použít řadu prefrakcionačních kroků, jimiž jsou nejčastěji dvourozměrná elektroforéza a chromatografické techniky.

Výsledky

1. Analytické parametry metody
   Měření opakovatelnosti jsme prováděli na dvou typech aktivních chromatografických čipů
   i) afinitní chromatografie na imobilizovaných iontech kovů (Cu²⁺, Ni²⁺ Co²⁺ atd.) tzv. IMAC
   ii) chromatografie vázající hydrofobní proteiny vazbou na nepolární povrch C12 tzv. H50. Na každém typu čipu jsme hodnotili tří píky s poměrem signál/šum > 10 v rozpětí 6 000 až 14 500 a.m.u.. Pro měření jsme použili směsné pacientské sérum bez přidání denaturačních činidel a vzorky jsme na čip nanášeli dle firemních protokolů. Na každém typu povrchu čipu jsme v 16 experimentech hodnotili tři vybrané hmotnostní fragmenty odpovídající třem hlavním píkům na spektrogramu.
2. Reprezentativní hmotnostní profily jednotlivých biologických materiálů
   Hmotnostní profily na obrázku 4 jsme získali analýzou plasmy, séra, izolovaných lymfocytů z periferní krve a lidské normální jaterní tkáně.
3. Klinický soubor melanomových nádorů:
   pro analýzu jsem vybrali sérum pacientů s diagnosou maligního melanomu léčených v MOÚ, jenž byli rozděleni na skupinu pacientů relativně chemosensitivních (n = 11) a relativně chemoresistentních (n = 14). U tohoto souboru nebyly k dispozici vzorky séra před resp. po terapii. Ve spektru plasmatických proteinů jsme pozorovali pouze dílčí změny mezi oběma uvedenými skupinami.
4. Klinický soubor germinálních nádorů:
   pro analýzu nízkomolekulárního proteomu jsme vybrali skupinu pacientů s diagnosou C62 léčených v MOÚ s kurativním záměrem. Každému pacientovi byla odebrána krev před a po chemoterapii, měli jsme tedy vzorky krve odebrané v čase. U 5 pacientů jsme nalezli rozdíly v proteomových spektrech. Spektra těchto pacientů se lišila v píku 11665,8 Da. V odebrané krvi před chemoterapií se tento pík vyskytoval, zatímco v odběru po chemoterapii již nebyl nalezen.
5. Klinický soubor her2- pozitivních pacientek s karcinomem prsu léčených herceptinem a chemoterapií:
   u tohoto souboru pacientek (n = 34) jsme provedli analýzu nízkomolekulárního sérového proteomu. Statistická analýza ukázala variabilní rozdíly v proteomových spektrech pacientek v průběhu terapie.

Diskuse

Technologie SELDI TOF se používá ve výzkumných laboratořích MOÚ Brno od roku 2004. Během této doby jsme provedli řadu analýz různých biologických materiálů (tkáně, extrakty buněčných kultur, pacientská séra, plasma, izolované buněčné subfrakce, materiál získaný pomocí laserové mikrodisekce), jejichž výsledky byly publikovány v řadě sdělení [9-12]. Při práci s technikou SELDI TOF jsme se setkali s řadou preanalytických a analytických problémů. SELDI TOF se nám jeví jako účinná semikvantitativní screeningová metoda schopná poskytnout prvotní informaci o profilu (fingerprintu) proteinů v analyzovaném materiálu, sama však není schopna identifikovat jednotlivé fragmenty.

Literatura

1. Shapiro, A., Vinuela, E., Maizel, J. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-poly-acrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967, 28(5), p. 815-820.
2. 
   Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P. G., Gianazza, E., Gorg, A., Westermeir, R., Postel, W. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys Methods, 1982, 6(4), p. 317-339.
3. Kenrick, G K., Margolis, J. Isoelectric focusing and gradient gel electrophoresis: a two-dimensional technique. Anal. Biochem., 1970, 33(1), p. 204-207.
4. Jensen, P K., Pasa-Tolic, L., Anderson, G A., Horner, J. A., Lipton, M. S., Bruce, J. E., et al. Probing proteomes using capillary isoelectric focusing-electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal Chem, 1999, 71(11), p. 2076-2084.
5. Chen, C, Walker, A., Wu, Y., Timmons, R. B., Kinsel, G R. Influence of sample preparation methodology on the reduction of peptide matrix-assisted laser desorption/ionization ion signals by surface-peptide binding. J Mass Spectrom, 1999, 34(11), p. 1205-1207.
6. Gorg, A., Postel, W., Gunther, S. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis, 1988;9(9), p. 531-546.
7. Cid, C, Garcia-Bonilla, L., Camafeita, E., Burda, J., Salinas, M., Alcazar, A. Proteomic characterization of protein phosphatase 1 complexes in ischemia-reperfusion and ischemic tolerance. 2007,7(17), 3207-3218.
8. Voet D, Voetová J. G, Biochemie. Praha: Victoria Publishing 1995, 1. Vydání, p. 192-193.
9. Helánová, S., Vyzula, R., Žaloudík, J., Nenutil, R., Müller, P, Češková, P., et al. Technologie Ciphergen nová perspektiva v proteomice nádorových onemocnění. Klinická onkologie, 2004, no.5, p. 157-161.
10. Pilny, R., Bouchal, P., Borilova, S., Ceskova, P, Zaloudik, J., Vyzula, R., et al. Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization/Time-of-Flight Mass Spectrometry Reveals Significant Artifacts in Serum Obtained from Clot Activator-Containing Collection Devices. Clin Chem, 2006, 52(11), p. 2115-2116.
11. Češková, P, Brožková, K., Hernychová, L., Štěrba, J., Valík, D., Vojtěšek, B. Hmotnostní spektrometrie v kvantitativní a diagnostické proteomice: možnosti a limitace. Chem. listy, 2006, 100(11), p. 974-979.
12. Brožková, K., Knoflíčková, D., Hernychová, L., Bouchal, P., Holčáková, J., Michalová, E., et al. Identifikace potenciálních biomarkerů karcinomu prsu metodou SELDI-TOF MS. Klinická onkologie, 2007, 20 (6), p. 377-383.

Grantové číslo: MZ0MOÚ2005