Relativní kvantifikace nádorově specifických antigenů MAGE u mnohočetného myelomu

Geny MAGE (Melanoma Antigen Gene) rodiny kódují antigenní peptidy, které jsou prezentovány HLA molekulami třídy I a rozpoznávány na lidských nádorech cytotoxickými T lymfocyty. MAGE patří mezi tzv. cancer/testis antigeny (CTA), které bývají exprimovány u mnoha typů solidních nádorů, avšak nikoliv ve zdravé tkáni. Jedinou zdravou tkání exprimující tyto antigeny jsou mužské zárodečné buňky (spermatogonie) a placentární trofoblast. MAGE antigeny jsou nádorově specifické, tudíž jsou využívány jako onkologické markery a při nádorové imunoterapii. MAGE se aktivují v nádorových buňkách následkem demetylace CpG dinukleotidů ve svých promotorech. Exprese MAGE A rodiny byla prokázána u melanomu karcinomu plic, vaječníků, močového měchýře, žaludku, jícnu, kolorektálního karcinomu, karcinomů hlavy a krku, neuroblastomu, mnohočetného myelomu (MM) a dalších malignit. Často bývají koexprimovány s jinými rodinami cancer/testis antigenů, např. BAGE, GAGE, NY-ESO-1/LAGE-1.
V myelomových buňkách byla prokázána přítomnost RNA transkriptů kódujících některé geny MAGE, nejčastěji MAGE A-1, MAGE A-3 a dále NY-ESO-1 a CT-7/MAGE-C1. Cílem této práce bylo zavedení metody kvantitativního stanovení nádorových antigenů u pacientů s MM, kteří jsou rovněž prospektivně sledováni po stránce genetické, biochemické a imunologické. Kvantitativní stanovení nádorových antigenů MAGE A-1 a MAGE A-3 bylo zavedeno pomocí metody Q-PCR v reálném čase na přístroji LightCycler (Roche Diagnostics, Germany). Toto vyšetření umožňuje vysoce specifickou, dobře reprodukovatelnou a citlivou kvantifikaci mRNA transkriptů v průběhu několika hodin. Z kostní dřeně nebo periferní krve se metodou TRIzol (Invitrogen) izoluje celková RNA, která se následně přepíše do cDNA s použitím Transcriptor reverzní transkriptázy. Pro Q-PCR se využívá systému dvojice fluorescenčně značených hybridizačních sond (FRET), které jsou komplementární k vnitřní části amplifikované sekvence. K relativní kvantifikaci se využívá ředící řady externího standardu, kterým je vhodně zvolený referenční gen (G6PDH). Cílová koncentrace je vyjádřena v poměru ke koncentraci referenčního genu měřené ve stejném vzorku. Optimalizace metody byla provedena na myelomové linii U266, která exprimuje MAGE A-1 a MAGE A-3. Metoda je ověřována na souboru pacientů s diagnózou monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS) a mnohočetný myelom (stádium tzv. doutnající myelom, I.A a pokročilá stadia). Výsledky kvantitativního stanovení antigenů MAGE u pacientů s různým stádiem onemocnění MM budou prezentovány.