Reaktivace proteinu p53 pomocí Amifostinu – experimentální studie v kvasinkovém expresním systému

Reaktivace nádorového supresoru p53 se v poslední době jeví jako jedna z možných strategií specificky cílené, protinádorové terapie. Protein p53 je transkripční faktor, který zajišťuje odpověď buňky na buněčný stres a poškození DNA tím, že aktivuje expresi řady cílových genů. Výsledkem aktivace je ovlivnění regulace důležitých buněčných procesů jako je apoptóza nebo zástava buněčného cyklu. U více než poloviny všech lidských nádorů se nachází mutace v genu p53. Tyto nádory často prokazují zvýšenou rezistenci ke konveční chemoterapii a radioterapii.
Vzhledem k tomu, že existuje vysoká variabilita ve funkčních vlastnostech jednotlivých p53 mutantů, je nutné vyvíjet i odlišné strategie k jejich reaktivaci. Teplotně závislí mutanti proteinu p53 jsou mutanti za restriktivních teplotních podmínek zcela inaktivní, u kterých za permisivních podmínek dochází k částečné nebo úplné obnově jejich transaktivačních schopností. Jsou tedy dobrým cílem strategie reaktivace proteinu p53 pomocí malých molekul. Jednou z těchto molekul je radioa chemoprotektivní látka Amifostin (S-2[3-aminopropylamino-] ethyl phosphorothioic acid, WR2721, Ethyol^®),která indukuje DNA vazebnou aktivitu standardního typu proteinu p53 a zcela nebo částečně obnovuje transaktivační schopnosti některých teplotně senzitivních mutantů exprimovaných za nepermisivních podmínek. V klinické praxi je Amifostin využíván při snižování vedlejších efektů různých druhů nádorových terapeutik.
Při studiu efektu Amifostinu na transaktivační schopnosti 22 teplotně závislých mutantů p53 jsme využili kvasinkového expresního systému, který mimo jiné využívá funkce p53 v buňkách Saccharomyces cerevisiae jako transkripčního faktoru, který je schopen na základě zbarvení kvasinkových kolonií semikvantitativně rozeznat různě funkční p53 mutanty. Bílé kolonie představují kvasinky transformované plně funkční variantou p53 proteinu, červené pak zcela nefunkční variantou. Kvasinkové kolonie, které byly transformované pouze částečně inaktivním mutantem p53 (např. teplotně závislým) vykazují fenotyp růžový. Efekt Amifostinu jsme analyzovali u 22 teplotně závislých p53 mutantů exprimovaných ve třech různých kvasinkových kmenech (s p53 responzivními elementy odvozenými z promotorů genů >i>p21, bax a RGC) při teplotách 25, 28, 30, 33 a 35 °C. Kvasinky rostly paralelně na médiu s Amifostinem a bez Amifostinu a účinek preparátu se projevil ve změně zbarvení kvasinkových kolonií. Tato změna byla nejlépe pozorována při kultivační teplotě 33°C, kde kvasinkové kolonie rostoucí bez Amifostinu vykazovaly červený fenotyp a kolonie rostoucí na médiu s Amifostinem růžový nebo bílý, což naznačovalo reaktivaci proteinu p53. Tento efekt byl pozorován pouze u některých mutantů p53 (E285K, S215G, P98A, G266E,Y205C,V272G, I195T, M237K, C135G, V216M,Y234C, A159V, V274G), přičemž většina těchto mutací (10/13) se nachází v hydrofobní, „β-sandwichové“ struktuře DNA vazebné domény proteinu p53. Tato doména nese dvě velké smyčky (L2 a L3) a motiv šroubovice-list-šroubovice umožňující přímou vazbu na DNA. Předpokládáme, že WR1065 tuto strukturu stabilizuje, čímž je zcela nebo částečně obnovena funkce celé DNA vazebné domény. Tito p53 mutanti se navíc lišili v odpovědi na účinek působení Amifostinu vzhledem k různým promotorům (p21, bax, RGC).
Výsledky naší práce naznačují, že protein p53 je konformačně flexibilní a jeho funkci lze reaktivovat pomocí malých molekul jako je Amifostin. Při identifikaci látek, které reaktivují transaktivační schopnosti proteinu p53 a mohou tak sloužit jako potenciální terapeutika, může být využita kvasinková funkční analýza. Navíc detailnější analýza funkčních a strukturních vlastností mutantů p53 a jejich podrobná stratifikace mohou být užitečné pro lepší pochopení účinků specifických mutantů na procesy vedoucí k transformaci nádorové buňky.

Poděkování: Tato práce je podporována grantem NR/8068-3 IGA MZ ČR a MSM 0021622415.