První zkušenosti s in vitro kultivací astrogliálních buněk z peroperačně získaných vzorků mozku.

Úvod
Astrogliální nádory mozku jsou charakterizovány agresívním růstem, nádorovou angiogenezí, rezistencí na radioterapii, chemoterapii a špatnou prognózou. Pro studium etiopatogeneze astrogliálních nádorů a efektu nových potenciálních terapeutik jsou potřebné nové buněčné linie.

Cíl
Cílem naší práce byla optimalizace postupu při izolaci a kultivaci nádorových a nenádorových astrogliálních buněk.

Materiál a metody
Byly odebrány tkáňové vzorky z primárního multiformního glioblastomu (grade IV) od muže, stáří 41 let a z nenádorové tkáně z okolí primárního lymfomu mozku od ženy, stáří 61 let. Tkáňové vzorky byly neprodleně homogenizovány a dále kultivovány v médiu DME F12 s 10% fetálního bovinního séra s přídavkem růstových faktorů: epidermálního růstového faktoru (EGF), inzulinu, hydrokortizonu a extraktu z hovězí epifýzy (BPE). Buňky derivované z glioblastomu vykazovaly srovnatelnou úroveň růstu i v médiu bez přídavku růstových faktorů. Buňky izolované z nenádorové tkáně vyžadovaly pro růst trvalou přítomnost růstových faktorů. První charakterizace izolovaných buněk byla provedena imunocytochemicky s použitím primárních protilátek proti: gliálnímu fibrilárnímu kyselému proteinu (GFAP), S 100 proteinu, vimentinu, nestinu, desminu, CD68 a PTEN. K vizualizaci antigenů pak byly použity fluorescenčně značené sekundární protilátky.

Výsledky
Buňky izolované z glioblastomu vykazovaly podstatně rychlejší růst než buňky izolované z nenádorové tkáně. Oba typy buněk se vyznačovaly astrocytární morfologií s několika dlouhými výběžky, avšak nádorové buňky byly menší a protáhlejší než nenádorové. Po 60-ti dnech kultivace docházelo k postupné růstové stagnaci nenádorových buněk a další změně morfologie. Rovněž docházelo ke ztrátě adherence a jejich částečnému odlučování od povrchu. Nenádorové buňky vykazovaly omezenou délku života pravděpodobně danou limitovaným počtem dělení. Pro jejich dlouhodobou kultivaci je nutná imortalizace. Provedli jsme proto stabilní transfekci genu pro telomerázu v plazmidu hTERTpClneo. Oba typy získaných buněk exprimovaly protein S 100 typický pro buňky neurálního původu, dále vimentin (marker pojivové tkáně a prekurzor GFAP u nezralých gliálních buněk). Je popsána koexprese vimentinu s GFAP u vyzrálých astrocytů, nikoliv gangliových buněk. Nepřítomnost svalového markeru desminu a markeru fagocytujících buněk CD68 (v CNS oligodendrocytů) vylučuje jejich svalový, případně oligodendrocytární původ. Marker kmenových buněk nestin byl detegován v nenádorových buňkách. Rovněž v buňkách izolovaných z glioblastomu byl nestin slabě přítomen pravděpodobně v souvislosti s nádorovou dediferenciací. GFAP hlavní cytoskeletální protein astrocytů v CNS, byl detegován v cytoplazmě nádorových buněk. Exprese GFAP u nenádorových buněk nebyla zaznamenána. Tento výsledek však nevylučuje méně vyzrálé formy astrocytů, kde GFAP nemusí být přítomen. Exprese nádorového supresoru PTEN, který bývá alterován v pokročilých stádiích nádorové progrese, byla zastižena v obou typech izolovaných buněk.

Závěr
Naše výsledky indikují možnost kultivace buněk izolovaných ze vzorků nádorové i nenádorové tkáně mozku. Vytvoření stabilní linie nenádorových astrogliálních buněk je však obtížnější vzhledem k nutnosti růstových faktorů v kultivačním médiu a imortalizaci buněk.

Práce byla podpořena granty: IGA MZ ČR NR/7828-3 a MSM 6198959216.