Konference: 2005 1. ročník Dny diagnostické, prediktivní a experimentální onkologie
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: 10. Nové možnosti protinádorové léčby
Číslo abstraktu: 078
Autoři: MUDr. Petr Džubák; doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.; MUDr. David Vydra; Prof. RNDr. Pavel Anzenbacher, CSc.; J. Šarek; MUDr. Petr Novák; doc.Ing.Dr Vladimír Havlíček
Na našem pracovišti se zabýváme hodnocením
cytotoxického účinku triterpenoidních látek odvozených od kyseliny
betulinové, které jsou syntetizovány na Katedře organické a jaderné
chemie, Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze.
Nejúčinnější z těchto sloučenin dosahují v cytotoxických testech hodnot IC50 = 0,2 µM. Zajímavé je, že tyto sloučeniny jsou účinné pro většinu testovaných nádorových linií a to i p53 negativních, pRb negativních, bez ohledu na jejich histogenetický původ, přičemž vykazují výrazně nižší toxicitu vůči nenádorovým buňkám. Molekulární mechanismy účinku studujeme na jednom z nejúčinnějších derivátů â-ketobetulinové kyselině (JS8) IC50 = 1 µM pro CEM buněčnou linii. Pokud se na námi zjištěné výsledky podíváme v časové dynamice tak již po 30 min. působení JS8 se uvolní cytochrom c, následně dochází k aktivaci kaspáz 3,8 a ke štěpení specifických substrátů PARPu a laminu B. Štěpení je možné zainhibovat jak pan-inhibitorem kaspáz Z-VAD-fmk, tak i acetylcysteinem, což je látka používaná jako antioxidant. Inhibice aktivace apoptózy pomocí acetylcysteinu nás vede k domněnce, že klíčovou roli bude hrát zvýšená produkce kyslíkových radikálů, případně změny v mitochondriálním respiračním řetězci. V této souvislosti pozorujeme časný nárůst produkce kyslíkových radikálů cca 10 min., zvýšení transmembránového mitochondriálního potenciálu (10–20 min.) a následné (30 min.) otevření mitochondriálních pórů. Tato pozorování podporuje i fakt, že indukce apoptózy byla významně inhibovaná nejen po působení acetylcysteinu, ale její nástup byl opožděn i po působení KCN, který je inhibitorem komplexu IV mitochondriálního respiračního řetězce, přičemž inhibitory komplexu I, III a V nevykazovaly protektivní efekt.
Výsledky naší stude naznačují, že molekulární cíl betulininu JS8 je lokalizován mezi komplexy III a IV mitochondriálního respiračního řetězce, kde dochází k ovlivnění transportu elektronů. Mezi těmito komplexy je hlavním přenašečem elektronů právě cytochrom c který se jeví cílovou molekulou našeho léčiva. Jeho roli v indukci apoptózy jsme studovali pomocí UV/VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie.
Naše pozorování zatím svědčí o nekompetitivní inhibici funkce cytochromu c, v důsledku čehož dochází k oxidačnímu vzplanutí v ošetřené buňce a následné apoptóze.
Publikované experimentální údaje a i naše zkušenosti nás vedou k závěru, že klasické mechanismy mnohočetné lékové rezistence se u derivátů kyseliny betulinové neuplatňují. Vzhledem k tomu, že se jedná také o nový cíl protinádorové chemoterapie, je vysoce pravděpodobné, že tyto sloučeniny mohou být přínosem pro pacienty s chemorezistentním, na léčbu nereagujícím, zhoubným oonemocněním.
Tato práce byla financovaná z grantů MSM6198959216, GAČR 301/03/1570 a MPO FT-TA/027.
Nejúčinnější z těchto sloučenin dosahují v cytotoxických testech hodnot IC50 = 0,2 µM. Zajímavé je, že tyto sloučeniny jsou účinné pro většinu testovaných nádorových linií a to i p53 negativních, pRb negativních, bez ohledu na jejich histogenetický původ, přičemž vykazují výrazně nižší toxicitu vůči nenádorovým buňkám. Molekulární mechanismy účinku studujeme na jednom z nejúčinnějších derivátů â-ketobetulinové kyselině (JS8) IC50 = 1 µM pro CEM buněčnou linii. Pokud se na námi zjištěné výsledky podíváme v časové dynamice tak již po 30 min. působení JS8 se uvolní cytochrom c, následně dochází k aktivaci kaspáz 3,8 a ke štěpení specifických substrátů PARPu a laminu B. Štěpení je možné zainhibovat jak pan-inhibitorem kaspáz Z-VAD-fmk, tak i acetylcysteinem, což je látka používaná jako antioxidant. Inhibice aktivace apoptózy pomocí acetylcysteinu nás vede k domněnce, že klíčovou roli bude hrát zvýšená produkce kyslíkových radikálů, případně změny v mitochondriálním respiračním řetězci. V této souvislosti pozorujeme časný nárůst produkce kyslíkových radikálů cca 10 min., zvýšení transmembránového mitochondriálního potenciálu (10–20 min.) a následné (30 min.) otevření mitochondriálních pórů. Tato pozorování podporuje i fakt, že indukce apoptózy byla významně inhibovaná nejen po působení acetylcysteinu, ale její nástup byl opožděn i po působení KCN, který je inhibitorem komplexu IV mitochondriálního respiračního řetězce, přičemž inhibitory komplexu I, III a V nevykazovaly protektivní efekt.
Výsledky naší stude naznačují, že molekulární cíl betulininu JS8 je lokalizován mezi komplexy III a IV mitochondriálního respiračního řetězce, kde dochází k ovlivnění transportu elektronů. Mezi těmito komplexy je hlavním přenašečem elektronů právě cytochrom c který se jeví cílovou molekulou našeho léčiva. Jeho roli v indukci apoptózy jsme studovali pomocí UV/VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie.
Naše pozorování zatím svědčí o nekompetitivní inhibici funkce cytochromu c, v důsledku čehož dochází k oxidačnímu vzplanutí v ošetřené buňce a následné apoptóze.
Publikované experimentální údaje a i naše zkušenosti nás vedou k závěru, že klasické mechanismy mnohočetné lékové rezistence se u derivátů kyseliny betulinové neuplatňují. Vzhledem k tomu, že se jedná také o nový cíl protinádorové chemoterapie, je vysoce pravděpodobné, že tyto sloučeniny mohou být přínosem pro pacienty s chemorezistentním, na léčbu nereagujícím, zhoubným oonemocněním.
Tato práce byla financovaná z grantů MSM6198959216, GAČR 301/03/1570 a MPO FT-TA/027.
Datum přednesení příspěvku: 10. 12. 2005
