Profily genové exprese kolorektálních nádorů ve vztahu k chemorezistenci a invazivitě

Úvod
V současné době neexistují laboratorní markery, které by dokázaly spolehlivě předpovědět účinnost určitého cytostatika v protinádorové terapii. Nejblíže realitě jsou zřejmě in vitro testy chemorezistence (MTT). Ani ty však nepracují spolehlivě, zejména u multimodálních terapií.
Neexistují ani testy, které by dokázaly spolehlivě předpovědět vznik metastatických ložisek.
Důvodem rozdílů mezi výsledky laboratorních testů in vitro a reálným vývojem nádoru jsou zřejmě:

1. heterogenita populací nádorových buněk (v důsledku heterogenity se nemusí podařit odebrat reprezentativní vzorek pro laboratorní vyšetření)
   
2. možnost odlišného chování nádorových buněk v odlišném prostředí kultivačních medií in vitro (např. jiné koncentrace folátu v mediích oproti stavu in vivo)
   
3. na vývoj chemorezistence a invazivity mají vliv různé humorální látky a imunologický dozor. Tyto vlivy jsou z in vitro testů eliminovány.

Nádory jsou známy svou heterogenitou jak morfologickou, tak heterogenitou na úrovni biochemických parametrů, antigenních determinant i na úrovni exprese genů.
Vzhledem k heterogenitě nádorů asi nebude možné najít jeden univerzální marker, pomocí kterého by bylo možné spolehlivě „nastavit“ optimální léčbu pacienta.
Navíc živé organismy mají velmi složité regulační systémy, často umožňující dosažení téhož cíle několika různými cestami. Proto je velmi pravděpodobné, že pro predikci vývoje nádoru a nastavení správné léčby bude nutné sledovat velké množství parametrů současně. Z technického hlediska je nejjednodušší sledování více parametrů na úrovni profilů genové exprese. Profily genové exprese jsou zajímavé i z hlediska spotřeby vzorku: pro stanovení profilů genové exprese stačí řádově miligramy nativní tkáně-lze tedy použít jakékoli bioptické techniky. Na rozdíl od proteinů je dobře připravená a správně skladovaná RNA nebo cDNA stabilní po mnoho let a může být tak použita i v retrospektivních studiích. Proto je v současné době věnováno velké úsilí hledání tumorových markerů na úrovni sledování genové exprese pomocí DNA, RNA arrays.

Pacienti, metodiky
Pro sledování expresních profilů byli vybráni pacienti s konkomitantní chemoradioterapií rektálního karcinomu s Xelodou (detaily viz. (1)) nebo pacienti, kteří podstoupili chirurgickou resekci kolorektálního nádoru a chemoterpii 5-FU režimy. Bioptický materiál u pacientů s konkomitantní chemoradioterapií byl odebírán z rekta před zahájením terapie a 14 dnů po zahájení terapie byly odběry opakovány. Odebráno bylo cca 10-30 mg nádorové tkáně a kontrolní nenádorové sliznice. Vše dle protokolu schváleného etickou komisí MOU.
Bioptický materiál byl ihned zmražen v kapalném dusíku nebo uložen v RNA Lateru, který zabraňuje degradaci RNA. Rozdíl mezi oběma způsoby uložení nebyl na úrovni cDNA arrays shledán.
RNA byla izolována pomocí TriReagentu (MRC Research, USA).
Reversní transkripce, značení cDNA biotinem a další kroky byly dělány dle standardních protokolů (2).

Pro hybridizaci jsme použili membránová arrays na nylonové matrici s geny vybranými pro metabolizmus xenobiotik a lékovou rezistenci nebo s geny asociovanými s udržováním a metabolizací extracelulární matrix (markery invazivity). RNA pro oligonukleotidová arrays (chemorezistence) jsme použili lineární amplifikaci RNA a značení biotinem dle standardních protokolů (3). Hybridizovaná cDNA nebo cRNA byla detekována po vazbě biotinu na avidin-fosfatázový konjugát chemiluminiscenční reakcí s CDPstar. Chemiluminiscenční obraz byl snímán chlazenou CCD kamerou ve formátu TIFF. Na tomto místě patří poděkování dr. Michalu Jurajdovi z Ústavu patofyziologie Masarykovy univerzity, který nám umožnil přístup k CCD kameře.
Obrazová analýza byla dělána pomocí veřejně přístupného programu ScanAlyze nebo TotalLab (díky za přístup k programu TotalLab Petru Millerovi, ZEO, MOU). Klastrová analýza byla dělána programem GeneCluster (Whitehead Institute, USA). Anotace a obrazová prezentace výsledků arrayí byla dělána programem GEAarray Analyzer. Obecná statistická analýza provedena programem Statistica TM, StatSoft, USA.

Výsledky
Exprese genů potenciálně důležitých pro invazivní vlastnosti nádoru
Genové expresní profily kontrolní sliznice před a v průběhu konkomitantní chemoradioterapie se příliš významně neliší
(obr.1 a,b, tab.1), což lze očekávat, neboť struktura extracelulární matrice buněk střevní sliznice je pro pacienta velmi důležitá
(vstřebávání živin střevní stěnou) a výrazné změny by byly zřejmě neslučitelné se životem.
Jinak je tomu ale u tumorů, kde je konkomitantní terapií u responderů indukován rozdíl v expresi celé řady genů (obr. 2, tab. 2). Největší je ovšem rozdíl mezi expresními profily kontrolní sliznice a tumoru – srovn. obr. 1 a obr. 2.
Profily genové exprese nebyly dosud validovány pomocí Real Time PCR.



Exprese genů asociovaných s metabolizmem xenobiotik a lékovou rezistencí

Genové expresní profily oligonukleotidových arrays (60 nt oligonukleotidové sondy) ukazují hladiny mRNA pro 263 genů. Z expresních profilů tumorové tkáně (obr. 3) vyplývá, že vysoké hladiny transkriptů odpovídají genům MDR1, některým členům rodiny P450 a proteinům kontrolujícím apoptotické dráhy. Porovnání expresních profilů nádoru s expresními profily kontrolní sliznice jsme dosud u tohoto typu arraye neprováděli.





Tab. 1 poměry hladin transkriptů po/před zahájením konkomitance – došlo k poklesu mRNA několika význačných markerů. Jako negativní hybridizač ní standard byl použ it pUC18.

Tab. 2 poměry hladin transkriptů po/před zahájením konkomitance – došlo k výrazným změnám v hladinách (poklesy i vzrůsty) mRNA většího počtu markerů. Jako negativní hybridizační standard byl použit pUC18.

Závěr
DNA arrays představují jeden z účinných nástrojů hledání nových diagnostických markerů. I když DNA arrays slouží k semikvantitativnímu stanovení hladin různých transkriptů a nejsou tudíž míněna jako standardní diagnostický nástroj, mohou přispět k relativně rychlému nalezení nových markerů a přispět tak k rychlému prosazení nových markerů v diagnostické praxi s využitím jiných přesnějších metodik.
Naše předběžné výsledky ukazují možnosti potenciálního využití profilů genové exprese při hledání markerů asociovaných s invazivitou a chemorezistencí.

Literatura

1. I. Kocakova, M. Svoboda, K. Klocova, S. Spelda, I. Kocak, P. Slampa, I. Penka, R. Sefr, R. Vyzula. Combined therapy of locally advanced rectal adenocarcinoma with capecitabine and concurrent radiotherapy. Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 22, No 14S (July 15 Supplement), 2004: 3720
   
2. Selinger DW, Cheung KJ, Mei R, Johansson EM, Richmond CS, Blattner FR, Lockhart DJ, Church GM. RNA expression analysis using a 30 base pair resolution Escherichia coli genome array. Nat Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1262-8.
   
3. Wang E, Miller LD, Ohnmacht GA, Liu ET, Marincola FM. High-fidelity mRNA amplification for gene profiling. Nat Biotechnol. 2000 Apr;18(4):457-9.