Konference: 2004 XXVIII. Brněnské onkologické dny a XVIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Molekulární a laboratorní diagnostika nádorů
Číslo abstraktu: 21
Autoři: doc. Mgr. Jan Bouchal, Ph.D.; K. Baumforth; Mgr. Michaela Šváchová; J. Knillová; Prof. Paul G. Murray; prof. MUDr. Zdeněk Kolář, CSc.
Úvod
Při léčbě hormonálně sensitivních karcinomů prostaty se standardně používá androgenová blokáda. Jedním z léků užívaných pro tyto účely je nesteroidní antiandrogen bicalutamid (Kolvenbag a Nash, 1999). V předchozích experimentech jsme zjistili, že bicalutamid, mimo jiné, inhibuje aktivitu telomerázy v androgen-sensitivní buněčné linii LNCaP. Telomeráza je reverzní transkriptáza zajišťující úplnou replikaci konců chromozómů. Tento enzym je aktivní u 90% nádorů a může sloužit jako diagnostický a prognostický znak, stejně jako terapeutický cíl (Hiyama a Hiyama, 2002).
Materiál a metody
Androgen-sensitivní (LNCaP) a androgen-nesensitivní (DU-145) buněčné linie byly kultivovány v médiu bez steroidů a ovlivněny 80 M bicalutamidem. Analýza genové exprese byla provedena pomocí HG-Focus Chip Arrays firmy Affymetrix. Aktivita telomerázy byla stanovena TRAP metodou (telomerase repeat amplification protocol; TRAPeze Telomerase detection kit, Intergen) a exprese transkriptu hTERT byla ověřena kvantitativní RT-PCR (Light Cycler TeloTAGGGhTERT quantification kit, Roche). Exprese vybraných proteinů byla sledována pomocí imunoblottingu.
Výsledky
Specifický účinek bicalutamidu, jako androgenového blokátoru, byl u androgen-sensitivní linie LNCaP vyjádřen poklesem hladiny mRNA prostatického specifického antigenu, prostatické kyselé fosfatázy a androgenového receptoru. Tyto geny nebyly u androgen-nesensitivní linie DU145 exprimovány a bicalutamidem nijak ovlivněny a celková genová odezva u této linie byla asi 3x nižší než u linie LNCaP. I když obě linie vykazovaly vysokou telomerázovou aktivitu, microarray analýza neprokázala expresi katalytické podjednotky telomerázy, hTERT. Její expresi jsme však zjistili pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Tento rozpor může být vysvětlen rozdílným způsobem reverzní transkripce mRNA. Při přípravě cDNA pro microarray analýzu byly použity oligo dT primery proti polyA konci mRNA. Transkript hTERT může podléhat posttranskripčním úpravám, při kterých dochází ke ztrátě polyA konce, a to může způsobovat falešně negativní výsledky. Naproti tomu při kvantitativní RT-PCR byly pro reverzní transkripci použity specifické primery. Analýza exprese hTERT touto metodou u androgen-sensitivní linie LNCaP prokázala po působení bicalutamidu pokles tohoto transkriptu a nárůst po stimulaci dihydrotestosteronem a 17-estradiolem, což ukazuje na regulaci exprese hTERT drahou androgenového receptoru. V této souvislosti jsme pozorovali také pokles hladiny mRNA onkogenu c-Myc, který je transkripčním faktorem hTERT a může také přispívat k autoregulaci androgenového receptoru (Oh a kol., 1999; Grad a kol., 1999). Exprese c-Myc na úrovni proteinu však byla zvýšena. Toto zvýšení exprese může souviset se stabilizací proteinu c-Myc a s indukcí buněčné smrti po působení bicalutamidu. Zvýšená exprese c-Myc nebyla v souhlase s poklesem hladiny mRNA hTERT. V regulaci promotoru hTERT pomocí c-Myc mohou hrát roli také proteiny Mad a Max a analýza jejich exprese je předmětem našeho dalšího výzkumu.
Závěr
Na uvedeném příkladu můžeme dokumentovat složitost interpretace stále častěji používaných mikročipových analýz. V této práci jsme pozorovali rozpor mezi microarray daty o expresi mRNA katalytické podjednotky telomerázy hTERT a onkogenu
c-Myc a jejich proteinovou expresí. Pokles telomerázové aktivity po působení bicalutamidu souvisel s poklesem exprese hTERT, která je pravděpodobně regulovaná přes androgenový receptor. Informace o expresi genů, získaná pomocí microarray analýzy, vyžadují ověření pomocí dalších metod.
Práce byla částečně podpořena granty MSM 151100001 a NC/7497-3.
Literatura
Při léčbě hormonálně sensitivních karcinomů prostaty se standardně používá androgenová blokáda. Jedním z léků užívaných pro tyto účely je nesteroidní antiandrogen bicalutamid (Kolvenbag a Nash, 1999). V předchozích experimentech jsme zjistili, že bicalutamid, mimo jiné, inhibuje aktivitu telomerázy v androgen-sensitivní buněčné linii LNCaP. Telomeráza je reverzní transkriptáza zajišťující úplnou replikaci konců chromozómů. Tento enzym je aktivní u 90% nádorů a může sloužit jako diagnostický a prognostický znak, stejně jako terapeutický cíl (Hiyama a Hiyama, 2002).
Materiál a metody
Androgen-sensitivní (LNCaP) a androgen-nesensitivní (DU-145) buněčné linie byly kultivovány v médiu bez steroidů a ovlivněny 80 M bicalutamidem. Analýza genové exprese byla provedena pomocí HG-Focus Chip Arrays firmy Affymetrix. Aktivita telomerázy byla stanovena TRAP metodou (telomerase repeat amplification protocol; TRAPeze Telomerase detection kit, Intergen) a exprese transkriptu hTERT byla ověřena kvantitativní RT-PCR (Light Cycler TeloTAGGGhTERT quantification kit, Roche). Exprese vybraných proteinů byla sledována pomocí imunoblottingu.
Výsledky
Specifický účinek bicalutamidu, jako androgenového blokátoru, byl u androgen-sensitivní linie LNCaP vyjádřen poklesem hladiny mRNA prostatického specifického antigenu, prostatické kyselé fosfatázy a androgenového receptoru. Tyto geny nebyly u androgen-nesensitivní linie DU145 exprimovány a bicalutamidem nijak ovlivněny a celková genová odezva u této linie byla asi 3x nižší než u linie LNCaP. I když obě linie vykazovaly vysokou telomerázovou aktivitu, microarray analýza neprokázala expresi katalytické podjednotky telomerázy, hTERT. Její expresi jsme však zjistili pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Tento rozpor může být vysvětlen rozdílným způsobem reverzní transkripce mRNA. Při přípravě cDNA pro microarray analýzu byly použity oligo dT primery proti polyA konci mRNA. Transkript hTERT může podléhat posttranskripčním úpravám, při kterých dochází ke ztrátě polyA konce, a to může způsobovat falešně negativní výsledky. Naproti tomu při kvantitativní RT-PCR byly pro reverzní transkripci použity specifické primery. Analýza exprese hTERT touto metodou u androgen-sensitivní linie LNCaP prokázala po působení bicalutamidu pokles tohoto transkriptu a nárůst po stimulaci dihydrotestosteronem a 17-estradiolem, což ukazuje na regulaci exprese hTERT drahou androgenového receptoru. V této souvislosti jsme pozorovali také pokles hladiny mRNA onkogenu c-Myc, který je transkripčním faktorem hTERT a může také přispívat k autoregulaci androgenového receptoru (Oh a kol., 1999; Grad a kol., 1999). Exprese c-Myc na úrovni proteinu však byla zvýšena. Toto zvýšení exprese může souviset se stabilizací proteinu c-Myc a s indukcí buněčné smrti po působení bicalutamidu. Zvýšená exprese c-Myc nebyla v souhlase s poklesem hladiny mRNA hTERT. V regulaci promotoru hTERT pomocí c-Myc mohou hrát roli také proteiny Mad a Max a analýza jejich exprese je předmětem našeho dalšího výzkumu.
Závěr
Na uvedeném příkladu můžeme dokumentovat složitost interpretace stále častěji používaných mikročipových analýz. V této práci jsme pozorovali rozpor mezi microarray daty o expresi mRNA katalytické podjednotky telomerázy hTERT a onkogenu
c-Myc a jejich proteinovou expresí. Pokles telomerázové aktivity po působení bicalutamidu souvisel s poklesem exprese hTERT, která je pravděpodobně regulovaná přes androgenový receptor. Informace o expresi genů, získaná pomocí microarray analýzy, vyžadují ověření pomocí dalších metod.
Práce byla částečně podpořena granty MSM 151100001 a NC/7497-3.
Literatura
- Grad JM, Dai JL, Wu S, Burnstein KL. Multiple androgen response
elements and a Myc consensus site in the androgen receptor (AR)
coding region are involved in androgen-mediated up-regulation of AR
messenger RNA. Mol. Endocrinol. 13: 1896-911, 1999.
- Hiyama E, Hiyama K. Clinical utility of telomerase in cancer.
Oncogene 21: 643-649, 2002.
- Kolvenbag GJCM, Nash A. Bicalutamide dosages used in the
treatment of prostate cancer. Prostate 39: 47-53, 1999.
- Oh S, Song YH, Kim UJ, Yim J, Kim TK. In vivo and in vitro analyses of Myc for differential promoter activities of the human telomerase (hTERT) gene in normal and tumor cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 361-5, 1999.
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2004
