Přínos techniky komparativní genomové hybridizace (CGH) k diagnostické a prognostické klasifikaci solidních dětských nádorů

Současný rozvoj molekulární medicíny klade stále vyšší požadavky na vývoj nových cytogenetických a molekulárně biologických metod, které by umožňovaly co nejkomplexnější analýzu genomu nádorové buňky a tím i stále přesnější stanovení vhodných genetických markerů, které specifikují způsob léčby a přispívají tak k individualizaci terapie.
Obdobně jako u hematologických malignit i v buňkách solidních nádorů se mohou vyskytovat specifické početní i strukturní chromozomové odchylky s diagnostickým a prognostickým významem. I přes pokroky v klasické a molekulární cytogenetice, je však dosud relativně málo známo o cytogenetických změnách u solidních nádorů. Důvodem jsou zejména technické obtíže při přípravě metafázních chromozomů z buněk solidních nádorů kultivovaných in vitro pro potřeby klasické cytogenetiky. Velkým pokrokem ovlivňujícím zejména cytogenetiku solidních nádorů bylo v minulých letech zavedení metody komparativní genomové hybridizace (CGH), která na základě vyšetření izolované DNA nádorových buněk umožňuje detegovat zisk i ztrátu sekvencí DNA (zejména amplifikace a delece) o minimální velikosti 5-10 Mb současně v jednom hybridizačním pokusu (Kallioniemi et al. 1992; du Manoir et al. 1993). Optimalizace technologie CGH postupně zlepšila citlivost, senzitivitu a spolehlivost této techniky a znamenala konverzi původně výzkumné metody v progresivní metodu laboratorní. Aplikace metod laserové mikrodisekce a DOP-PCR umožňuje dnes studovat genetické změny u nádorů již na základě několika ng disektované tumorové DNA nebo z archivovaného materiálu. V průběhu uplynulých let se tak podařilo pomocí CGH shromáždit řadu poznatků o podstatě chromozomových změn již u více než 17 000 případů 80 různých typů maligních tumorů (http://www.helsinki.fi/cmg). V současné době jsou intenzivně rozvíjeny další modifikace techniky CGH, zejména CGH s vysokou rezolucí, tzv. HR-CGH (Kirchhoff et al. 2001) či array-CGH (Solinas-Toldo et al., 1997), které umožňují podrobný celogenomový screening zaměřený na amplifikace, delece konkrétních genů zúčastněných v maligní transformaci buňky.
Technologie CGH významně přispěla k rozvoji molekulární diagnostiky nádorů. Na základě molekulárních analýz opakovaně amplifikovaných či deletovaných úseků chromozomů již byla identifikována řada onkogenů a tumor supresorových genů zapojených do procesu karcinogeneze leukémií, lymfomů a solidních tumorů. Výsledkem celogenomového screeningu a porovnáním častých klonálních chromozomových abnormalit, který byl proveden u stovek tumorů pomocí techniky CGH, bylo zjištění, že existují chromozomové anormality, které jsou jedinečné a typické pro určitý typ nádoru. Na druhé straně byly nalezeny chromozomové změny, které se opakovaně u všech typů nádorů (např. delece13q a zisk 8q) (Mertens et al. 1997).
Pomocí srovnávacích analýz primárních tumorů a metastáz byly též získány důležité informace o úloze a typu časných genetických změn a o specifických genetických odchylkách typických pro progresi některých nádorů.
Klinicky významné informace s ohledem na prognózu onemocnění a volbu terapie může poskytnout i celkový počet chromozomových odchylek prokázaný v nádorovém materiálu. Předpokládá se, že vysoký počet genetických abnormalit detegovaný pomocí CGH je obecně indikátor genetické nestability a koreluje s nepříznivou prognózou a chováním nádoru.
U řady solidních nádorů jsou již dnes pomocí techniky CGH cíleně vyšetřovány nejen specifické chromozomové aberace, ale i tzv. přidatné (sekundární) aberace. Tyto změny mohou upozorňovat na onemocnění rezistentní vůči terapii s rizikem progrese či recidivy. Tak např. u ětského nádoru neuroblastomu již dnes existují klinicky ověřené údaje, které umožňují přesnější stratifikaci pacientů do jednotlivých rizikových skupin nejen na základě molekulárně cytogenetického průkazu (FISH) amplifikace N–myc onkogenu, delece 1p36 a nadbytečného materiálu na chromozomu 17 (gain 17q), ale i za pomocí dalších genetických odchylek, jejichž přítomnost definuje samostatné subtypy s výrazně odlišnou prognózou vyžadující zohlednění v léčebné strategii (Vandesompele et al. 2002).
Metodou CGH bylo zjištěno, že u ranných stádií neuroblastomu dochází ke zmnožení celých chromozomů, zatímco pro pokročilá stádia choroby jsou typické spíše strukturní aberace postihující nenáhodně zvláště oblasti 3p, 9p, 11q a 14q (Brinkschmidt et al. 1997; Vandesompele et al. 1998). Pomocí CGH je možno prokázat deleci 11q až u 20% primárních neuroblastomů, a to především u pokročilých stádií a bez amplifikovaného N-myc onkogenu či delece 1p36 (Breen et al. 2000; Planatz et al. 2001). Tato genetická podskupina je navíc charakterizovaná vyšším věkem pacientů, nepříznivou histologií a dalšími delecemi jako jsou delece 3p, 4p a 14q. Předpokládá se, že podskupina nádorů s delecí 3p a 11q představuje zvláštní subtyp agresivního neuroblastomu s podobnou nepříznivou prognózou jako u nádorů s N-myc amplifikací (Spitz et al. 2003). Obdobně je studována prognostická významnost nadbytečného materiálu 1q23 a delece 14q, které byly nalezeny pomocí CGH u dalších subtypů neuroblastomu (Hirai et al. 1999).
Mezi nejčastější specifickou chromozomovou abnormalitu u meduloblastomu, která se vyskytuje téměř u 50% případů, patří izochromozom 17q. Tuto změnu je možné postihnout také pomocí CGH, a to jako ztrátu 17p a nadbytečný materiál v oblasti 17q (Nicholson et al. 2000). Mezi další nejčastější změnu detegovatelnou pomocí CGH patří amplifikace c-myc a N-myc onkogenu, přičemž tyto změny představují pro pacienta s meduloblastomem nepříznivou prognózu (Nishizaki et al. 1999).
Ewingovy sarkomy se vyznačují specifickými chromozomovými aberacemi postihujícími chromozom 22, t(11;22)(q24;q12) a méně často t(21;22)(q22;q12), výjimečně byly popsány t(7;22)(q22;q12), t(17;22)(q12;q12) nebo komplexní translokace postihující chromozom 11 a 22. Kromě uvedených translokací, které jsou primární, se u Ewingových sarkomů vyskytují ještě sekundární chromozomové aberace – trizomie nebo dokonce tetrazomie 8 a 12 chromozomu a translokace t(1;16)(q10-21;q10-13), která často vede ke zmnožení kopií 1q a k deleci 16q. K detekci těchto sekundárních změn je možné použít také metody CGH. Zda se tyto sekundární chromozomové aberace podílejí na vývoji chování Ewingových sarkomů není dosud zcela jasné. Trizomie 8 a 12 chromozomu je prokazována častěji v relapsech než v primárních nádorech. Mezi sekundární změny patří také trizomie chromozomu 2 a klinické údaje naznačují, že tato sekundární změna je spojena s lepší prognózou (Brisset et al. 2001).
Jiným poměrně častým nádorem v dětském věku je Wilmsův tumor. Cytogenetická studia prokázala, že u pacientů s Wilmsovým nádorem dochází často k deleci krátkých ramen 11p v oblasti 11p13 a 11p15. Ke zjišťování zisků a ztrát dalších chromozomových oblastí důležitých pro vývoj tohoto onemocnění byla již mnohokrát použita technika CGH (Altura al. 1996; Steenman et al. 1997; Getman et al. 1998). Tyto práce opakovaně prokázaly trizomie chromozomových oblastí 1q, 7q, 8, 12 a delece úseků 1p, 4p, 4q, 7p, 16q, 18q, 21q a 22q. Z výsledků provedených analýz také vyplývá, že výskyt nadbytečného materiálu v oblasti 1q u pacientů s Wilmsovým tumorem souvisí s příznivější histologií a snižuje riziko relapsu (Hing et al. 2001).
Rutinní využívání technologie CGH v oblasti solidních nádorů tak stále více přispívá k tomu, že diagnostické a klasifikační systémy založené na cytomorfologických charakteristikách nádorových buněk jsou postupně doplňovány a v některých případech i nahrazovány klasifikací genetickou vycházející vedle poznatků molekulárně genetických i ze závěrů stále účinnějších molekulárně cytogenetických analýz.
V našem sdělení prezentujeme výsledky CGH analýz u souboru 40 pacientů se solidními dětskými dětskými tumory vyšetřovanými na OLG FN Brno.

Literatura

1. Altura, R. A., Valentine, M. et al.: Identification of novel regions of deletion in familial Wilms’ tumor by comparative genomic hybridization. Cancer Res. 56, 3837-41,1996.
   
2. Breen, C. J., O’Meara, A. et al.: Coordinate deletion of chromosome 3p and 11q in neuroblastoma detected by comparative genomic hybridization. Cancer Genet. Cytogenet. 120, 44-49, 2000.
   
3. Brinkschmidt, C., Christiansen, H. et al.: Comparative genomic hybridization (CGH) analysis of neuroblastomas – an important methodological approach in pediatric tumour pathology. J. Pathol. 181, 394-400, 1997.
   
4. Brisset, S. Schleiermacher, G. et al.: CGH analysis of secondary genetic changes in Ewing tumors: correlation with metastatic disease in a series of 43 cases. Cancer Genet Cytogenet. 130, 57-61, 2001.
   
5. Du Manoir, S., Speicher, M. R. et al.: Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization. Hum. Genet. 90, 590-610, 1993.
   
6. Getman, M. E., Houseal, T. W. et al.: Comparative genomic hybridization and its application to Wilms’ tumorigenesis. Cytogenet Cell Genet. 82, 284-90, 1998.
   
7. Hing, S., Lu, Y. J. et al.: Gain of 1q is associated with adverse outcome in favorable histology Wilms’ tumors. Am J Pathol.
   158, 393-8, 2001.
   
8. Hirai, M., Yoshida, S.: 1q23 gain is associated with progressive neuroblastoma resistant to aggressive treatment. Genes, Chromosomes Cancer 25, 261-269, 1999.
   
9. Kallioniemi, A., Kallioniemi, O. P. et al.: Comparative genomic hybridizations for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 258, 818-821, 1992.
   
10. Kirchhoff, M., Rose, H. et al.: High resolution comparative genomic hybridisation in clinical cytogenetics. J. Med. Genet. 38, 740-744, 2001.
    
11. Mertens, F., Johansson, B. et al.: Chromosomal imbalance maps of malignant solid tumors: a cytogenetic survey of 3185 neoplasms. Cancer Res. 57, 2765-2780, 1997.
    
12. Nicholson, J., Wickramasinghe, C. et al.: Imbalances of chromosome 17 in medulloblastomas determined by comparative genomic hybridisation and fluorescence in situ hybridisation. Mol Pathol. 53, 313-9, 2000.
    
13. Nishizaki, T., Harada, K. et al.: Genetic alterations in pediatric medulloblastomas detected by comparative genomic hybridization. Pediatr Neurosurg. 31, 27-32, 1999.
    
14. Planatz, D., Vandesompele, J.: Comparative genomic hybridization (CGH) analysis of stage 4 neuroblastoma reveals high frequency of 11q deletion in tumors lacking MYCN amplifi cation. Int. J. Cancer 91, 680-686, 2001.
    
15. Spitz, R., Hero, B. et al.: FISH analyses for alterations in chromosomes 1,2,3, and 11 define high-risk groups in neuroblastoma. Med. Pediatr. Oncol. 41, 30-35, 2003.
    
16. Solinas-Toldo, S., Lampel, S. et al.: Matrix-based comparative genomic hybridization: biochip to screen for genomic imbalances. Genes Chrom. Cancer 20, 399-407, 1997.
    
17. Steenman, M., Redeker, B. et al.: Comparative genomic hybridization analysis of Wilms tumors. Cytogenet Cell Genet. 77,
    296-303,1997.
    
18. Vandesompele, J., Baudis, M. et al.: Identification of clinico-genetic subgroups in neuroblastoma by cluster analysis of CGH data. Abstracts of 8th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Cytogenetics of Human Solid Tumours, Barcelona, p.101, 2002.
    
19. Vandesompele, J., Van Roy, N. et al.: Genetic heterogeneity of neuroblastoma studied by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes and Cancer 23, 141-152, 1998.

Práce byla podpořena granty MŠM ČR 143100008 a MZ 00065269705