Predikce léčebné odpovědi k cílené terapii trastuzumabem u pacientek s karcinomem prsu

Úvod: trastuzumab je humanizovaná monoklonální protilátka proti extracelulární doméně receptoru Her-2/neu (dále jen Her-2), jehož nadměrná exprese (Her-2+) je detekována přibližně u 15-25% karcinomů prsu, které se vyznačují agresivním biologickým chováním. Trastuzumab je v současnosti jedinou látkou použitelnou k cílené terapii těchto karcinomů v adjuvantní i paliativní léčbě. V kombinaci s chemoterapií prokazatelně významně zvyšuje léčebnou odpověď, prodlužuje čas do progrese/relapsu onemocnění i celkové přežití pacientek. Na straně druhé výsledky klinických studií rovněž ukázaly, že existuje i opačná strana mince, a to v podobě primární a sekundární rezistence nádorového onemocnění k trastuzumabu, která se může týkat 60 až 80% takto léčených pacientek. Pomineme-li situaci, kdy příčina selhání léčby spočívá v progresi onemocnění v centrálním nervovém systému, tedy v kompartmentu relativně nedostupném pro trastuzumab, je možné mechanismy primární a sekundární rezistence k trastuzumabu u Her-2+ onemocnění rozdělit na čtyři základní skupiny:

1. ovlivnění vazby trastuzumabu k Her-2 receptoru. K negativnímu ovlivnění vazby trastuzumabu k Her-2 receptoru může docházet : a) mutací genu, která se projeví změnou struktury receptoru, b) maskováním vazebných epitopů receptoru, např. membránovými glykoproteiny muciny, c) štěpením extracelulární domény (ECD) receptoru prostřednictvím metalloproteas skupiny ADAM. Po odštěpení ECD zůstává v buňce transmembránová a cytoplazmatická část původního Her-2 receptoru, označována rovněž jako p95Her-2, která paradoxně vykazuje silnou signální (tyrosinkinasovou) aktivitu. Navíc některé klinické práce dokazují, že vysoká koncentrace ECD Her-2 ovlivňuje biologický poločas a dostupnost trastuzumabu.
   
2. změna vazebných interakcí uvnitř receptorové sítě. Po navázání ligandu dochází k heterodimerizaci mezi jednotlivými receptory ErbB rodiny (EGFR, Her-2, Her-3 a Her-4), která vede k jejich aktivaci. K aktivaci Her-2 signální dráhy může docházet i v důsledku homodimerizace Her-2 receptoru v případě jeho výrazného nadbytku. Na dimerizačním partnerovi Her-2 receptoru závisí nejenom stabilita receptorové dvojice, ale i intenzita aktivity Her-2 signální dráhy. Oba faktory ovlivňují účinnost trastuzumabu.
   
3. zvýšená tvorba ligandů ErbB receptorů. Auto- a parakrinní sekrece heregulinu a EGF byla v preklinických studiích jednou z příčin inhibice účinnosti trastuzumabu.
   
4. alternativní stimulace Her-2 receptoru a jeho signálních drah: PI3K/Akt a Ras/MAPK signální dráhy. PI3K/Akt a Ras/MAPK signální dráhy regulují procesy buněčného přežívání, proliferace, diferenciace a metabolismu. Aktivace uvedených signálních drah nastává v důsledku stimulace i řady dalších receptorů růstových faktorů (např. IGF-1R) nebo receptorů adheze (integriny, muciny). Jsou popisovány i přímé stimulace Her-2 receptoru uvedenými receptory, a to nezávisle na jeho dimerizaci s dalšími členy ErbB receptorové rodiny. Stálá aktivace PI3K/Akt signální dráhy může být rovněž způsobena ztrátou funkce fosfatasy PTEN. Alternativní stimulace Her-2 receptoru a jeho signálních drah se významnou měrou podílí na primární i sekundární rezistenci k trastuzumabu.

Mechanismy, které přispívají ke vzniku rezistence karcinomu prsu na cílenou terapii trastuzumabem, předurčují i způsoby možného řešení této situace. Do jednotlivých fází klinického zkoušení se již dostaly nové monoklonální protilátky, které jsou schopné blokovat vazbu Her-2 receptoru k několika dimerizačním partnerům (např. pertuzumab), bispecifické protilátky (např. MDX-H210, 2B1), reverzibilní a ireverzibilní nízkomolekulární inhibitory kinasové aktivity jednotlivých ErbB receptorů, nebo jejich skupin (např. lapatinib, CI-1033). Ve fázi klinického zkoušení jsou rovněž inhibitory kinas: Akt (Perifosine, QLT394, VD0002), MAPK (SCIO-469, PD325901) a mTOR (Temsirolimus, Everolimus, Rapamycin).

Metodika: v rámci výzkumného projektu podporovaného Interní grantovou agenturou MZ ČR jsme na modelu pacientek s metastatickým Her-2 pozitivním (IHC stanovená exprese Her-2 receptoru na 3+ nebo FISH metodou prokázaná amplifikace Her-2/neu genu) karcinomem prsu studovali mechanismy rezistence k trastuzumabu, s cílem identifikovat molekulární prediktivní markery použitelné pro běžnou klinickou praxi. Analyzovaný soubor tvořilo celkem 112 pacientek (věkový rozptyl 23 až 75 let, medián 51 let), které byly v letech 2000 až 2007 léčené paliativní protinádorovou terapií založenou na aplikaci trastuzumabu. Tato léčba probíhala nejčastěji v kombinaci s taxany (83% pacientek), pouze 5% pacientek bylo léčeno monoterapií trastuzumabem. U více než poloviny případů (53%) se jednalo o použití trastuzumabu v první linii paliativní léčby. První a druhá linie pak představovaly 88 % všech režimů. Do listopadu 2007 zprogredovalo 72 % pacientek, 25 % z nich v CNS.

V souboru byly realizovány dva základní typy analýz. V prvním případě (86 pacientek) jsme studovali vztah sérové koncentrace extracelulární domény Her-2 receptoru (ECD-Her-2) k základním klinickým a biologickým charakteristikám nádorového onemocnění. Stanovení ECD-Her-2 bylo provedeno vždy před první aplikací trastuzumabu a dále v období jeho podávání, a to 60 až 90, 90 až 130 dnů a dále á 2 až 3 měsíce, až do progrese choroby. Podobně jsme detekovali sérovou koncentraci tří dalších markerů: extracelulární domény receptorů Her-3 a IGF-1R, ligandu IGF-1 a standardních nádorových markerů CA 15-3 a CEA. Druhý typ analýzy byl zaměřen na vlastnosti primárních tumorů, v jejichž vzorcích (76 pacientek), uchovaných v parafinových blocích po fixaci formalínem, jsme imunohistochemicky vyšetřovali expresi a případně i aktivitu vybraných molekulárních markerů, souvisejících se signální drahou Her-2 receptoru a s mechanismy vzniku primární nebo sekundární rezistence k trastuzumabu. Jednalo se o proteiny: aktivovanou formu Her-2 receptoru p-Her-2-1221 a p-Her-2-1248, Akt kinasu 1 a 2 a její aktivované formy p-Akt-473 a p-Akt-308, S6K kinasu a její aktivovanou formu p-S6K-235/236, mTOR a jeho aktivovanou formu p-mTOR-2448, GSK3beta a aktivovanou formu p-GSK3beta-9, a dále proteiny PTEN a Mucin-4.

U každého ze studovaných markerů jsme analyzovali, zda ovlivňuje efektivitu cílené léčby charakterizovanou parametrem TTP - časem do progrese onemocnění/time to progression. P-hodnoty statistické významnosti byly založeny na Gehan-Wilcoxonově testu nebo Chi-kvadrátovém testu a pouze P-hodnoty ≤0,05 byly považovány za signifikantní. Ke stanovení TTP byla použita Kaplan-Meierova metoda a statistická závislost byla stanovena na základě logrank testu.

Výsledky: Analýza sérových markerů prokázala, že ECD-Her-2 je nejčastěji detekovaný elevovaný nádorový marker v séru pacientek s metastatickým Her-2+ karcinomem prsu. Koncentrace ECD-Her-2 překračující diskriminační hodnotu 15 µg/l byla zjištěna u 60 z 86 testovaných pacientek, tj. 70%. Pro srovnání, pozitivita CEA a CA15-3 markeru byla zjištěna u 47% a 59% pacientek. Koncentrace ECD-Her-2 vyšší než 25,2 µg/l (medián měřených hodnot) před zahájením léčby predikovala horší prognózu (medián TTP 366 vs 251 dnů, p=0,0045, Hazard Ratio 0,509, CI 95% 0,296-0,800). Na základě vývoje sérových koncentrací ECD-Her-2 v průběhu léčby trastuzumabem bylo možné odlišit 4 různé typy dynamiky ECD-Her-2. Typ dynamiky predikoval prognózu vývoje onemocnění, a to jak ve smyslu dosažené odpovědi na terapii s trastuzumabem, tak i času do progrese onemocnění. Pokles sérové koncentrace ECD-Her-2 pod diskriminační mez v době mezi 90. až 130. dnem léčby predikoval lepší prognózu (medián TTP 366 vs 201 dnů, p=0,0003, Hazard Ratio 0,3501, CI 95% 0,0758-0,4702). Zajímavým se stal výsledek sledování dynamiky markerů ve skupině pacientek, jejichž onemocnění zprogredovalo v CNS v době, kdy extrakraniálně bylo úspěšně kontrolováno podávanou léčbou. Zjistili jsme, že u těchto pacientek docházelo ze sledovaných markerů nejčastěji k elevaci ECD-Her-2 (p=0,0036). Elevace ECD-Her-2 byla nejčastěji detekovatelným markerem v době před/nebo při zjištění progrese choroby (bez závislosti na jejím místě) (p=0,021/p=0,0149). Dalším zajímavým zjištěním bylo, že pacientky, které pokračovaly v léčbě trastuzumabem i přes progresi onemocnění (za současné změny režimu chemoterapie), měly stejnou prognózu bez ohledu na koncentraci ECD-Her-2 v době progrese choroby, ve srovnání s pacientkami, u kterých po progresi pokračovala systémová léčba bez trastuzumabu. Ve druhé skupině byla zvýšená koncentrace ECD-Her-2 spjata s kratším EFS (event free survival), který byl definován jako 2. progrese choroby nebo úmrtí pacientky (medián EFS 219 vs 113 dnů, p=0,022, Hazard Ratio 0,407, CI 95% 0,124 – 0,853). Analýza sérových koncentrací Her-3, IGF-1R a ligandu IGF-1 neprokázala na daném klinickém modelu prediktivní význam.

Z molekulárních markerů analyzovaných pomocí imunohistochemického vyšetření jsme zjistili, že pacientky s karcinomy, které měly vysokou expresi Akt-2 kinasy se současnou přítomností aktivované p-Akt-473 kinasy v buněčném jádře, měly lepší prognózu, než ostatní (medián TTP 399 vs 233 dnů, p=0,0017, Hazard Ratio 2,094, CI 95% 1,12 – 3,49). Pokud byla za stejných okolností v jádře detekována společně s p-Akt-473 i p-Akt-308 byla pozitivní prediktivní hodnota vyšší (medián TTP 637 vs 233 dnů, p=0,0036, Hazard Ratio 2,79, CI 95% 1,33 – 4,41). Kromě Akt kinasy jsme, z dosud zpracovaných výsledků, potvrdili prediktivní význam i u S6K kinasy.

Závěr: Zásadní úlohu v indikaci a aplikaci receptor-cílené terapie představuje v současnosti průkaz cílové struktury v nádorových buňkách a do budoucna vyhodnocení molekulárních prediktivních markerů rezistence. Naše výsledky prokazují význam sledování sérové koncentrace extracelulární domény Her-2 receptoru a aktivity a kompartmentalizace Akt kinasy pro predikci odpovědi Her-2+ karcinomu prsu na paliativní protinádorovou léčbu s trastuzumabem.

Poděkování: Práce byla podpořena grantovým projektem IGA MZ ČR NR/8335-3