Praktické použití cobas® PIK3CA mutačního testu

V roce 2004 vědci v Johns Hopkins Kimmel Cancer Center a Howard Hughes Medical Institute nalezli mutace v genu PIK 3CA spojené s tumor genezí a progresí onemocnění tlustého střeva a jiných karcinomů. Je jedním z nejvíce mutovaných onkogenů uvedených v lidských nádorech. Většina hlášených mutací se vyskytuje v několika tzv. hotspotech v genu (kodony 1047 (~ 40%), 545 (~ 25%), a 542 (~ 13%)). Pacienti s nádory, které obsahují PIK 3CA mutace, mohou mít prospěch z léčby zaměřené na mutantní PIK 3CA nebo navazující cíle v metabolické dráze. Existují tři třídy PI3Ks, třída IA PI3K je ta, která je spojována s lidským karcinomem. PIK 3CA je 34 kb gen na chromozómu 3q26.3, který se skládá z 20 exonů kódujících 1068 aminokyselin tvořících protein velikosti 124 kDa. Kóduje p110α katalytickou podjednotku a je aktivován stimulací růstového faktoru prostřednictvím tyrosinkinázových receptorů (RTKs) a G-proteiny vázanými receptory. Cesta PIK 3 moduluje růst, proliferaci, metabolismus, přežití a angiogenezi. Mutace může způsobit rezistenci k apoptóze, podporovat buněčnou migraci a invazi in vitro i in vivo. PI3K je v srdci signalizace receptoru růstového faktoru a kontroly buněčného cyklu a proto je slibným cílem léčby EGFR monoklonálními protilátkami. Mutační stav PIK 3CA není vzájemně exkluzivní k EGFR nebo KRAS. Bylo prokázáno, že KRAS a PIK 3CA koexistují v CRC a k překonání rezistence bude potřebné cílení na obě cesty. Omezené údaje ukazují, že stav PIK 3CA mutací exonu 9 v mCRC nemá vliv na účinnost cetuximabu s chemoterapií, ale mutace v exonu 20 byly spojeny s nízkou odpovědí. PIK 3CA mutace se zdají být negativním prediktorem k terapii EGFR monoklonálními protilátkami.

Mutační test cobas® PIK 3CA je real-time PCR test určený výhradně pro výzkumné účely (research use only – RUO) pro kvalitativní detekci a identifikaci mutací v exonech 1,4,7,9 a 20 fosfoinositid-3-kinázy, katalytického, alfa (PIK 3CA) genu v DNA derivované z formalin parafinované (FFPET) tkáně. Vzorky jsou zpracovány pomocí soupravy cobas® DNA Sample Preparation Kit pro manuální přípravu vzorku a pomocí analyzátoru cobas® z 480 pro automatizovanou amplifikaci a detekci. Test cobas® PIK 3CA Mutation Test je založen na dvou hlavních procesech: (1) manuální příprava vzorku za účelem získání genomické DNA z FFPET; (2) PCR amplifikace a detekce cílové DNA pomocí komplementárních párů primerů a oligonukleotidových sond označených fluorescenčním barvivem. Test je určen k detekci R88Q v exonu 1, N345K v exonu 4, C420R v exonu 7, E542K, E545X (E545A, E545D8*, E545G a E 545K), Q546X (Q546E, Q546K, Q546L a Q546R) v exonu 9 a M1043I, H1047X (H1047L, H1047R, H1047Y) a G 1049R v exonu 20, když je procentní mutace 5% nebo vyšší. Detekce mutace se děje pomocí PCR analýzy na analyzátoru cobas® z 480. V každém cyklu probíhá kontrola mutace a negativní kontrola za účelem potvrzení platnosti cyklu. Pro detekci mutací zacílených v tomto testu jsou použita čtyři různá reportovací barviva. Amplifikace cílových sekvencí PIK 3CA je detekována nezávisle v průběhu tří reakcí a to měřením fluorescence na čtyřech charakteristických vlnových délkách optických kanálů.

Z jedné soupravy cobas® PIK 3CA mutačního testu lze vyšetřit 24 vzorků při minimální velikosti běhu 3 vzorky. K dispozici jsou činidla pro 8 běhů po 3 vzorcích plus kontroly. Mutační Kontrola (PIK 3CA MC) a Negativní Kontrola musí být zahrnuty v každém běhu. Vyhodnocení výsledků provádí řídící software plně automaticky a výsledky jsou k dispozici za méně jak 8 hodin od začátku izolace DNA z FFPET řezu.