Použití polymerázové řetězové reakce v reakčním objemu 1 μl pro detekci mutací genu EGFR.

   Druhé místo na světě mezi maligními onemocněními zaujímají nádory plic. V České republice jsou na prvním místě v příčinách úmrtí na zhoubné nádory. U nemalobuněčných karcinomů plic vyšetřujeme mutace genu pro receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR; ^[1]). EGFR je exprimován jak normálními, tak maligními buňkami, významným způsobem ovlivňuje průběh buněčného cyklu, buněčné proliferace a diferenciace a přežití buňky. Mutace jsou jednou z příčin jeho nekontrolované aktivace ^[2]. Proto je EGFR důležitým cílem pro protinádorovou terapii, kdy se inhibuje jeho funkce monoklonálními protilátkami nebo nízkomolekulárními tyrozinkinázovými inhibitory a využívá se tak blokáda jeho signální dráhy ^[3] v léčebných indikacích.

   Přestože je v naší laboratoři PCR zavedená pro nádorovou diagnostiku a predikci na několik způsobů, stále hledáme možnosti, jak ušetřit (např. snížením objemu reakce) a jak maximálně využít omezené množství nádorového materiálu. Na real-time cyklérech Light Cycler 480 II (Roche) již běžně používáme objem reakce 10 μl, na 7500 Fast real-time PCR system (Life Technologies) 5 μl. Ve snaze minimalizovat objem reakce jsme využili nabídky zapůjčení PCR cykléru AmpliSpeed ASC200D (Beckman Coulter), umožňujícího provádět PCR reakci v objemu 1 μl na speciálně upraveném podložním sklíčku ^[4]. Výrobce garantuje provedení PCR od vstupního množství DNA 100 pg.

   Přístroj jsme využili k PCR detekci deleční mutace genu EGFR při vyšetření nemalobuněčného karcinomu plic s následnou fragmentační analýzou na genetickém analyzátoru CEQ 8800 (Beckman Coulter), agarózové elektroforéze nebo 2100 Bioanalyzer (Agilent). Vyzkoušeli jsme tři druhy reakčních směsí (míchaná z jednotlivých běžných chemikálií (Genetica), GoTaq® qPCR Master Mix (Promega) a AmpliGrid GoTaq® PCR System (Beckman Coulter). Jako nejlepší se ukázala být třetí uvedená reakční směs. Testovali jsme schopnost cykléru provést nejen standardní PCR (teplota denaturace 95 °C), ale i COLD PCR (co-amplification at lower denaturation temperature-PCR, 88 °C). V následné analýze jsme byli schopni detekovat deleci ze vstupního množství DNA 62,5 pg a při zastoupení 1,56 % mutované DNA ve wild-type DNA při standardním i COLD PCR principu. AmpliSpeed se tak jeví, že by mohl vyhovovat požadavkům na analýzu mutací DNA o nízké koncentraci (v našem případě plazmy).

Literatura:

1. doi: 10.2210/rcsb_pdb/mom_2010_6
2. (2) http://www.somaticmutations-egfr.info
3. (3) Gazdar AF (2009) Personalized medicine and inhibition of EGFR signaling in lung cancer. N Engl J Med. 361(10):1018-20.
4. (4) http://www.advalytix.com

Poděkování: Projekt byl částečně financován z grantů CZ.1.05/2.1.00/01.0030, MPO TIP FR TI1 525, MSM6198959216. Za zapůjčení přístroje děkujeme firmě Beckman Coulter.