Platinový derivát LA-12 je schopen překonat rezistenci závislou na konfluenci u buněk kolorektálního karcinomu HT-29.

Kolorektální karcinom je v ČR jedním z nejčastějších nádorových onemocnění. Ve světových statistikách jsme byli první na světě v jeho incidenci r.1997 (Adam et al., 2004). Jedná se o onemocnění cylindrického epitelu tlustého střeva a rekta. Včasnou diagnostiku komplikuje pomalý zdvojovací čas nádoru a nespecifické příznaky vyplývající z lokality vzniku. Chemoterapie je jednou z modalit spolupodílejících se na léčebném algoritmu tohoto onemocnění.
Některé adherentní epiteliální buněčné linie - např. derivované z kolorektálního karcinomu - vykazují v laboratorních podmínkách mnohem větší rezistenci k protinádorovým látkám se stoupajícím stupněm konfluence (Dimanche-Boitrel, 1993). V těchto podmínkách byla pozorována snížená akumulace farmaka v buňkách - antracykliny - nebo snížená citlivost buněk k testovaným chemoterapeutikům - cisplatina, melfalan (Dimanche-Boitrel, 1992).
V naší práci se zabýváme studiem platinových derivátů v praxi již využívaných ve srovnání s novým platinovým (PtIV) derivátem LA-12, který je momentálně zařazen do klinického testování fáze I. Cisplatina (CDDP) jako nejstarší zástupce této skupiny se využívá k léčbě např. ovariálních a testikulárních nádorů. Její využití je limitováno závažnými vedlejšími účinky (nefrotoxicita, kardiotoxicita, emesa, neurotoxicita) a vznikem či existencí rezistence nádorových buněk k ní (kolorektální karcinom atd). Vývoj chemoterapeutik na bázi cisplatiny vedl k objevu dalšího léčebného preparátu - oxaliplatiny. Ta vykazuje jiné spektrum protinádorové aktivity než CDDP (kolorektální karcinom, nádory prsu atd.) a také jiné nežádoucí vedlejší účinky periferní senzorická neuropatie, emesa, hematologická suprese. Oba tyto preparáty je nutné podávat převážně nitrožilně.
Nový preparát LA-12 [(OC-6-43)-bis(acetato)(1-adamantylammine)dichloroplatinum(IV)] byl poprvé popsán v r. 2004 (Žák et al., 2004). Jedná se o čtyřmocný platinový preparát s objemným hydrofóbním ligandem adamantylaminem, který je zodpovědný za lepší vstup LA-12 do buňky. Preparát je lépe rozpustný a je ho tudíž možno aplikovat perorálně. Při studiu účinků LA-12 na mnoha buněčných nádorových liniích, jak citlivých, tak rezistentních k CDDP byla prokázána významně vyšší účinnost LA-12 ve srovnání s CDDP.
Mechanismus účinku platinových cytostatik je nejlépe prostudován u nejznámější látky této podskupiny CDDP. Za hlavní je považována interakce Pt derivátu s DNA. Nejdůležitější je tvorba vnitrořetězcových a meziřetězcových aduktů a dále aduktů DNA - protein. Jakou úlohu hrají jednotlivé adukty v cytotoxicitě není dosud jednoznačně známo. Předpokládá se u nich zejména vliv na syntézu DNA, transkripci a indukci apoptózy.
Námi testované látky CDDP, oxaliplatina a LA-12 byly studovány na dobře popsaném modelu buněčné linie kolorektálního adenokarcinomu HT-29, získaném v roce 1964 z tumoru ženy (44 let). Jedná se o dobře diferencovaný karcinom grade I.
Cílem naší práce bylo zjistit, zda LA-12 bude vykazovat vyšší účinnost než cisplatina a oxaliplatina a zda je schopna překonat rezistenci závislou na různém stupni konfluence (Pelletier et al, 1990).
V první fázi byla stanovena toxicita sledovaných látek v různém stupni konfluence (50x103, resp. 180x103 buněk/cm2). K tomuto účelu byl použit test metabolické aktivity (MTT) založený na enzymatické redukci tetrazoliové soli na nerozpustný formazan. Porovnáním hodnot IC50 (koncentrace inhibující 50% aktivity mitochondriálních enzymů) se LA-12 ukázala být nejúčinnější ze všech 3 látek. Z cytotoxicity můžeme odvodit míru rezistence závislé na konfluenci (CDR) C/NCratio) (Dimanche-Boitrel, 1992). I v tomto parametru vykazovala LA-12 nejvyšší aktivitu. Mechanismus účinku byl vzhledem k neúčinnosti CDDP a oxaliplatiny u konfluentní populace nadále studován pouze pro LA-12. Počet adherentních buněk klesal a počet buněk plovoucích narůstal v závislosti na koncentraci a čase. Viabilita hodnocená barvením eosinem výše uvedené výsledky potvrdila. Podíl apoptotických buněk (podle hodnocení morfologie buněčných jader barvených pomocí DAPI ve fluorescenčním mikroskopu) koreloval s počtem plovoucích buněk. Buněčný cyklus byl analyzován průtokovou cytometrií (barvení propidium jodidem) po působení IC50 v časových intervalech 24, 48 a 72 hod. u obou stupňů konfluence. Hlavním efektem byl nárůst podílu buněk v S fázi trvající po celou dobu experimentu.
Z výše popsaných výsledků je zřejmé, že LA-12 vykazuje nejvyšší cytotoxicitu ze všech studovaných látek. LA-12 má nejsilnější účinek i na počet plovoucích a přisedlých buněk, což koresponduje i se snižující se viabilitou v různém stupni konfluence. Tato látka je schopna indukovat apoptotickou smrt u buněk HT-29 ve všech studovaných časových intervalech a v různých stupních konfluence a způsobuje zpoždění v S fázi buněčného cyklu s postupným přechodem do G2/M.

Literatura

1. Adam Z, Vorlíček J, Vaníček J. Diagnostické a terapeutické postupy u maligních chorob, kolorektální karcinom, 95-111, ISBN 80-247-0896-5, grada publishing, 2004;
   
2. Kinetic resistance to anticancer agents. Cytotechnology. 1993;12(1-3):347-56
   
3. Confluence-dependent resistance in human colon cancer cells: role of reduced drug accumulation and low intrinsic chemosensitivity of resting cells. Int J Cancer. 1992; Mar 12;50(5):677-82
   
4. Žák F., Turánek J., Kroutil A., et al. Platinum(IV) komplex with adamantylamine as nonleaving amine group: Synthesis, characterization, and in vitro antitumor aktivity against a panel cisplatin. resistant cancer cell lines. J Med Chem. 2004; Jan 29;47(3):761-3
   
5. Mechanisms of resistance of confluent human and rat colon cancer cells to anthracyclines: alteration of drug passive diffusion. Cancer Res. 1990; Oct 15;50(20):6626-31

Tato práce byla podporována granty GA ČR 301/03/H005, 301/07/1557, grantem Ministerstva průmyslu a obchodu ČR, No. PZ-Z2/29 „New Medicines for Cancer Therapy“ a grantem 1QS500040507 AV ČR.