Ověření senzitivity elektrochemického stanovení metalothioneinu jako potencionálního markeru nádorových onemocnění

Úvod
Metalothionein, protein se schopností vázat těžké kovy o molekulové hmotnosti okolo 7 kDa, byl objeven v roce 1957 Margoshesem a Valeem, kteří ho izolovali z koňských ledvin. Výzkum metalothioneinů je stále velmi intenzivní, což dokládá fakt, že do července roku 2005 bylo v databázi Web of Science více než 8500 odkazů, které obsahovali v názvu, klíčových slovech anebo abstraktu výraz „metallothionein*“. V databázi Expert Protein Analysis System (ExPASy) Proteomics Server byly v roce 2005 popsány čtyři skupiny metalothioneinů: MT1, MT2, MT3 a MT4. Molekulové hmotnosti těchto metalothioneinů se pohybují od 6.0 – 6.9 kDa, počet aminokyselin v polypeptidickém řetězci se pohybuje kolem 61 a hodnota isoelektrického bodu kolísá kolem hodnoty 8.3. Pouze MT3 má ve své molekule 68 aminokyselin a hodnota isoelektrického bodu byla vypočtena jako 4.8. Doposud nejvíce zařazených a identifikovaných metalothioneinů je ve skupině lidských, MT1 metalothioneinů (MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1I, MT1K, MT1L a MT1R). Zjistilo se, že obsah jednotlivých aminokyselin je u jednotlivých lidských metalothioneinů obdobný.

Absolutně nejvíce je u všech skupin MT zastoupena aminokyselina cystein (více než 30 %). V molekule MT vytváří dvacet cysteinů klastery v několika se vyskytujících repeticích: Cys- X-Cys, Cys-Cys-X- -Cys-Cys, Cys-X-Cys-Cys, kde X představuje jinou aminokyselinu než cystein. Mezi další významně zastoupené aminokyseliny patří A, K, S a G, a dále se v molekule MT nevyskytují aromatické aminokyseliny. Molekuly metalothioneinu vytváří díky cysteinům struktury se dvěma vazebnými doménami pro atomy kovů označované jako α a β. Ačkoliv byl MT objeven před více jako 40 lety, jeho biologická funkce v organismu není stále uspokojivě objasněna. MT se účastní řady fyziologických procesů, jako je homeostáza kovů a jejich detoxikace, ochrana před oxidačním poškozením, v buněčné proliferaci a apoptóze či chemoči radioterapeutické rezistenci buněk. MT izoformy mohou souviset s řadou změn v procesu karcinogeneze, vývoje a progrese nádorových onemocnění. MT exprese může být také spojena s cytoprotektivním efektem vyvolaným zraněním a stresovou reakcí. Lze se domnívat, že MT může být využit jako potenciální marker nádorové diferenciace a buněčné proliferace anebo jako ukazatel prognózy nádorového onemocnění.

Cíl
Práce je zaměřena na senzitivní analýzu metalothioneinu pomocí elektrochemických technik.

Materiály a metody
Biologický materiál: Jako biologické vzorky byly použity orgány ryb (okoun říční, Perca fluviatilis) odchycených v roce 2004 v řece Svratce. Získané vzorky jednotlivých tkání (svalovina, gonady, játra a slezina) byly do doby analýzy MT zamraženy na -20 °C. Vzorky pro analýzu byly připraveny podle postupů uveřejněných dříve. Zjednodušeně: vzorek byl umístěn na 99 °C do termobločku (Eppendorf 5430, USA) na 15 min, poté ochlazen. Denaturované proteiny byly odstraněny centrifugací při 4 °C a 15 000 g po dobu 30 min. (Eppendorf 5402, USA). Jako standard byl použit králičí metalothionein (Sigma, Aldrich).

Elektroanalytické stanovení metalothioneinu pomocí AdTS CPSA
Vzorky byly analyzovány na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm², referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Základní elektrolyt (0,1 M H₃BO₃ + 0,05 M Na₂B₄O₇ (Sigma Aldrich, ACS), pH = 8,0) byl po každých 5 analýzách vyměněn. AdTS CPSA parametry byly následující: počáteční potenciál -0,1 V, konečný potenciál -1,8 V, aplikovaný proud I = -1 µA, doba akumulace byla 90 s, teplota 20 °C. Pro úpravu získaných experimentálních dat bylo využito GPES software EcoChemie.

Výsledky
V našich experimentech byl MT stanoven technikou adsorptivní přenosové techniky (AdTS) v kombinaci s chronopotenciometrií (CPSA) při aplikovaném proudu 1 µA, při vyšších vkládaných proudech je získána horší elektrochemická odezva. Metalothionein v množství 1 ng/ml poskytoval velmi dobře reprodukovatelný signál při potenciálu kolem -1,70 V. Podobný katalytický signál MT byl získán i v našich předešlých experimentálních pracích. MT byl adsorbován na povrch pracovní elektrody po různou dobu akumulace. Získali jsme závislost s pozorovaným maximem při 90 s. Koncentrační závislost nebyla v celém úseku lineární, a proto byla rozdělena na dva lineární úseky 0–2 ng MT/ml (y = 14386x + 129,55; R² = 0,9916) a 2–20 ng MT/ml (y = 2134, 2x + 24520; R² = 0,996), n = 3, S. D. = 8%. Uvedený postup byl dále ověřován pro detekci MT v biologických vzorcích. Pro naše experimenty bylo využito tkání ryb. Okouni velikosti 10–20 cm (Perca fluviatilis) byli vyloveni v řece Svratce v létě roku 2004 a jednotlivé tkáně (svalovina, gonády, játra a slezina) byly do doby analýzy MT zamraženy na -20 °C. Pomocí námi vypracovaného postupu byl detekován obsah metalothioneinu v jednotlivých tkáních okounů. Nejvyšší obsahy MT byly pozorovány v játrech a slezině (100–350 ng MT/g). Z dostupných údajů je známo, že významný je obsah MT také v gonádách všech obratlovců, v našich experimentálních vzorcích se obsah pohyboval mezi 25 až 250 ng MT/g). Předpokládá se, že v těchto orgánech probíhá velmi intenzivní metabolismus kovů, a proto jsou zde detoxikační mechanismy velmi účinné, a tak je i obsah MT relativně vysoký. Avšak námi nově vyvinutá a navržená metodika nabízí stanovení MT i v tkáních, kde to doposud nebylo možné. Zjistili jsme, že obsahy MT byly ve svalovině zkoumaných ryb skutečně velmi nízké a pohybovaly se v jednotkách až desítkách ng/g. Všechny zkoumané ryby byly zdravé a nebyly vystaveny žádnému kontrolované experimentální dávce těžkých kovů. Koncentrace těžkých kovů v řece jsou nízké, avšak obsah MT v rybách zcela jistě ovlivňují. Proto zjištěný obsah MT pravděpodobně souvisí jednak s i) metabolismem jednotlivé ryby a ii) délkou jejího života, tedy její expozici těžkým kovům.

Závěr
MT představuje nový potenciální marker pro diagnostiku nádorových onemocnění anebo zátěže životního prostředí člověka. Z tohoto důvodu je nezbytné popsat vhodné analytické postupy, které umožní snadnou, rychlou, přesnou a levnou diagnostiku. Jak se ukazuje, elektrochemické metody mohou tyto podmínky splnit.

Poděkování. Tato práce byla podpořena granty: GA ČR 525/04/P132, RASO 8/2005 a MŠMT 6215712402.

Literatura

1. Petrlova J, Blastik O, Prusa R, Kukacka J, Potesil D, Mikelova R, Adam V, Zehnalek J, Kizek R: Using of electrochemical methods for studying of metallothionein content in the human blood serum of a patient poisoned by lead and treated by platinum. Biomed Papers 2005; 149 (2): in press.
2. Prusa R, Blastik O, Potesil D, Trnkova L, Zehnalek J, Adam V, Petrlova J, Jelen F, Kizek R: Metallothioneins as a marker of tumor diseases. Clin Chem 2005; 51 (6): A56.
3. Prusa R, Kizek R, Trnkova L, Vacek J, Zehnalek J: Study of relationship between metallothionein and heavy metals by CPSA method. Clin Chem 2004; 50 (6): A28–A29.
4. Kizek R, Trnkova L, Palecek E: Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopotentiometry. Anal Chem 2001; 73 (20): 4801–4807.
5. Trnkova L, Kizek R, Vacek J: Catalytic signal of rabbit liver metallothionein on a mercury electrode: a combination of derivative chronopotentiometry with adsorptive transfer stripping. Bioelectrochemistry 2002; 56 (1–2): 57–61.
6. Kizek R, Vacek J, Trnkova L, Klejdus B, Havel L: Application of catalytic reactions on a mercury electrode for electrochemical detection of metallothioneins. Chem Listy 2004; 98 (4): 166–173.
7. Palecek E, Masarik M, Kizek R, Kuhlmeier D, Hassmann J, Schulein J: Sensitive electrochemical determination of unlabeled MutS protein and detection of point mutations in DNA. Anal Chem 2004; 76 (19): 5930–5936.
8. Strouhal M, Kizek R, Vacek J, Trnkova L, Nemec M: Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica. Bioelectrochemistry 2003; 60 (1–2): 29–36.
9. Petrlova J, Potesil D, Mikelova R, Blastik O, Adam V, Trnkova L, Jelen F, Prusa R, Kukacka J, Kizek R: Attomole voltammetric determination of metallothionein. Electrochim Acta 2005; submitted.